Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l’isolamento e l’espansione delle cellule mononucleari periferiche derivate dalle cellule citochine- indotte CD3–CD56– cellule killer e illustrare il loro effetto di citotossicità contro le cellule tumorali ematologiche e solide utilizzando un sistema di citometria di flusso di diagnosi invitro.
L’immunoterapia cellulare adottiva si concentra sul ripristino del riconoscimento del cancro tramite il sistema immunitario e migliora l’uccisione efficace delle cellule tumorali. La terapia con cellule T indotta da citochine (CIK) per esercitare effetti citotossici significativi contro le cellule tumorali e per ridurre gli effetti negativi della chirurgia, delle radiazioni e della chemioterapia nei trattamenti contro il cancro. Il CIK può essere derivato da cellule mononucleari periferiche del sangue (PBMC), midollo osseo e sangue del cordone ombelicale. Le cellule CIK sono una sottopopolazione eterogenea di cellule T con CD3–CD56e caratteristiche fenotipiche natural killer (NK) che includono l’attività antitumorale senza restrizioni del complesso di istocompatibilità (MHC). Questo studio descrive un metodo qualificato, clinicamente applicabile, basato sulla citometria di flusso per la quantificazione della capacità citolytica delle cellule CIK derivate da PBMC contro le cellule tumorali ematologiche e solide. Nel saggio citolitico, le cellule CIK sono co-incubate a diversi rapporti con cellule tumorali bersaglio prestainte. Dopo il periodo di incubazione, il numero di cellule bersaglio è determinato da una macchia legante acido nucleico per rilevare le cellule morte. Questo metodo è applicabile sia alle applicazioni di ricerca che a quella diagnostica. Le cellule CIK possiedono una potente citotossicità che potrebbe essere esplorata come strategia alternativa per il trattamento del cancro dopo la sua valutazione preclinica da parte di un sistema di citometria basato su citometro (CS & T).
I linfociti Citotossici sono una popolazione specifica di cellule eretritarie immunitarie che mediano le risposte immunitarie contro il cancro. Diverse popolazioni di cellule efleganti, tra cui cellule killer attivate da linfocini (LAK), linfociti infiltrati di tumore (TIL), cellule NK , cellule di z T, e cellule killer indotta da citochine (CIK) sono stati sviluppati per scopi di terapia at-cellule adottivi (ACT)1. C’è un crescente interesse per le cellule CIK, perché rappresentano una miscela di popolazioni di cellule citototossiche indotte da citochine espanse da cellule mononucleari del sangue periferico autologhe (PMBC)2.
La crescita incontrollata di cellule progenitrici linfoidi, mieloblasti e linfoblasti porta a tre principali tipi di tumori del sangue (ad esempio leucemia, linfoma e mieloma), tumori solidi, tra cui carcinomi (ad esempio, cancro del polmone, cancro gastrico, cancro cervicale) e sarcomi, tra gli altri cancri3. Le cellule CIK sono una miscela di popolazioni cellulari che presentano una vasta gamma di attività antitumorali unrestricted complex (MHC) -unrestricted e quindi promettono per il trattamento dei tumori ematologici e avanzati4,5,6,7. Le celle CIK sono costituite da una combinazione di celle, tra cui le celle T (CD3,CD56),le cellule NK-T (CD3,CD56) e le cellule NK (CD3–CD56). L’ottimizzazione del protocollo di induzione del CIK mediante l’uso di un programma fisso per l’aggiunta di anticorpi IFN-z, anti-CD3 e IL-2, comporta l’espansione delle cellule CIK8. La capacità citototossica delle cellule CIK contro le cellule tumorali dipende principalmente dall’impegno del membro D del gruppo NK 2 (un membro della famiglia di recettori simili alla lectina di tipo C) ligando NKG2D sulle cellule tumorali e sulle vie mediate da perforina9. I risultati di uno studio preclinico hanno rivelato che le cellule CIK stimolate da IL-15 hanno indotto la potente citotossicità potente contro le linee cellulari della leucemia mieloide primaria e acuta in vitro e hanno mostrato una minore alloreattività contro i normali PBMC e i fibroblasti9. Recentemente, è stato pubblicato il risultato dell’infusione di CIK (1 x 108/kg dicellule CD3) come consolidamento a seguito del trapianto allogeneico non mieloablativo per il trattamento dei neoplasmi mieloidi in uno studio clinico di fase II.
Nel presente studio, abbiamo sviluppato una formula di coltura cellulare ottimizzata composta da ifN-z, IL-1, anticorpi anti-CD3, e IL-2 aggiunto al mezzo cellulare ematopoietico per aumentare la produzione di CIK, e studiato l’effetto citotossico delle cellule CIK contro le malattie umane croniche leucemia mieloide (K562) cellule e cellule tumorali ovariche (OC-3).
Il metodo descritto è un protocollo veloce, conveniente e affidabile per l’isolamento e l’espansione di cellule T killer citotototossiche indotte da citotozi (CIK) da campioni di t di donatori sani. Mostra anche l’effetto citotossico del CIK contro la leucemia (K562) e le cellule tumorali ovariche (OC-3) utilizzando un sistema di localizzazione e tracciamento della citometria a flusso (CS & T). Le cellule CIK possono essere indotte ed espanse in buone pratiche manufactoryli (GMP) utilizzando citochine di grado GMP e mez…
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato supportato dal China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).
7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | ||
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | SN: R33896202856 | |
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO | |
D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | Basal medium for OC-3 cell culture | |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | Density gradient solution | |
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 | |
Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 | Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C. | |
Proleukin | NOVARTIS | Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | ||
Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C | |
Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | ||
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature | |
X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q | Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C |