Summary

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Published: November 09, 2019
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Summary

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Abstract

Los macrófagos son células fagocíticas especializadas en la detección de moléculas de origen no propio. Con este fin, están equipados con una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar, ya que el reactivo de transfección y los ácidos nucleicos transinfectados a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por lo tanto, la transfección a menudo resulta en la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transinfectados o incluso en el suicidio de los macrófagos. Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios murinos como macrófagos peritoneales (PM) y macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con ARNm en vitro transcrito a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Con este sencillo protocolo, se alcanzan tasas de transfección de aproximadamente 50-65% para PM y de aproximadamente 85% para BMDM sin citotoxicidad ni inmunogenicidad observada. Describimos en detalle la generación de ARNm para la transfección a partir de construcciones de ADN como plásmidos y el procedimiento de transfección.

Introduction

Los macrófagos son células fagocíticas que se especializan en la detección, ingesta y degradación de microbios, células apoptóticas y desechos celulares. Además, ayudan a orquestar las respuestas inmunitarias secretando citoquinas y quimioquinas y presentando antígenos a las células T y células B. Los macrófagos también desempeñan un papel importante en numerosos otros procesos, como la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, la tumorigenesis y la obesidad.

Para poder detectar moléculas no propias, como los patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) y las moléculas fuera de lugar, como los patrones moleculares asociados al daño (DAPP), los macrófagos están equipados con una amplia gama de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)1. Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar2 como el reactivo de transfección3 y los ácidos nucleicos transinfectados4,5,6,7 a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por esta razón, la transfección de macrófagos utilizando métodos químicos o físicos8 suele dar lugar a la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transcijos o incluso en el suicidio de macrófagos a través de la piroptosis, una forma de muerte celular lítica programada desencadenada después del reconocimiento de Los PamP/DMIP citosólicos, como el ADN o el ARN extraño9. La transfección biológica de macrófagos utilizando virus como adenovirus o lentivirus como vectores es a menudo más eficiente, sin embargo, la construcción de estos vectores virales es lenta y requiere equipos de nivel 2 de bioseguridad10,11.

Así, aunque los macrófagos son objeto de una intensa investigación, el análisis de sus funciones a nivel molecular se ve obstaculizado porque una de las herramientas más importantes de la biología molecular, la transfección de construcciones de ácido nucleico para la expresión exógena de proteínas, no es aplicable. Esto a menudo obliga a los investigadores a utilizar líneas celulares similares a macrófagos en lugar de macrófagos de buena fe. Las aplicaciones para la transfección de construcción de ácido nucleico incluyen la expresión de versiones de proteínas mutadas o etiquetadas, la sobreexpresión de una proteína específica, la reexpresión de proteínas en un fondo de eliminatoria respectivo y la expresión de proteínas de otras especies (por ejemplo. , Cre recombinase o ARN guía y Cas9 para el knockout genético dirigido).

Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios (generalmente difíciles de transfectar), es decir, macrófagos peritoneales murinos (PM) y macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) con ARNm generado a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Es importante destacar que el ARNm transcrito in vitro generado con este protocolo contiene los nucleósidos modificados de origen natural 5-metil-CTP y pseudo-UTP que reducen la inmunogenicidad y mejoran la estabilidad4,6,7,12,13. Además, los 5′-extremos del ARNm transcrito in vitro son desfosforilados por la fosfatasa antártica para evitar el reconocimiento por el complejo RIG-I14,15. Esto minimiza el reconocimiento inmune innato del ARNm transcrito in vitro. Con nuestro protocolo fácil de realizar, se alcanzan tasas de transfección entre 50-65% (macrófagos peritoneales (PM)) y 85% (BMDM) mientras que, lo que es importante, no se observacitotoxicidad ni inmunogenicidad. Describimos en detalle (i) cómo el ARNm silenciado inmunológicamente para la transfección se puede generar a partir de construcciones de ADN como plásmidos y (ii) el propio procedimiento de transfección.

Protocol

El aislamiento de macrófagos de ratones se realizó de conformidad con la Ley de Protección Animal de Alemania en cumplimiento con el Comité de ética de la Universidad de Colonia. NOTA: Lleve a cabo todos los pasos con guantes. Llevar a cabo todos los pasos de transfección bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las células. Antes de trabajar con ARNm, limpie todos los instrumentos, como pipetas y todas las superficies con un 70% de etanol y/o …

Representative Results

Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar codificación mRNA para las variantes ETIQUETADAs por FLAG NEMO e IKK para la transfección de macrófagos primarios16. La codificación de plásmidos para el tipo salvaje con etiqueta FLAG (NEMOWT) y C54/347A mutante NEMO (NEMOC54/374A) (véase la Tabla de Materiales) ya contienen un promotor T7 en la orientación correcta(Figura 1A</…

Discussion

Aquí presentamos un protocolo para la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios generalmente difíciles de transfectar con ARNm transcrito in vitro. Es importante destacar que la transfección de los macrófagos utilizando este protocolo no induce la muerte celular ni activa la señalización proinflamatoria, lo que indica que ni el reactivo de transfección ni el ARNm transfectóse se reconocen como no autónomos.

La calidad del ARNm es de vital importancia para el éxito de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

References

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Cite This Article
Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

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