Summary

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Published: November 09, 2019
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Summary

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Abstract

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisiert sind. Zu diesem Zweck sind sie mit einer großen Auswahl an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ausgestattet. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz und die transfizierten Nukleinsäuren von den PRRs oft als nicht-selbst erkannt werden. Daher führt die Transfektion oft zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Selbstmord der Makrophagen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von murinen primären Makrophagen wie Peritonealmakrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA in vitro aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden transkribiert ermöglicht. Mit diesem einfachen Protokoll werden Transfektionsraten von etwa 50-65% für PM und etwa 85% für BMDM erreicht, ohne dass Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet werden. Wir beschreiben detailliert die Generierung von mRNA für die Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und dem Transfektionsverfahren.

Introduction

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die sich auf die Erkennung, Einnahme und Erniedrigung von Mikroben, apoptotischen Zellen und zellulären Ablagerungen spezialisieren. Darüber hinaus helfen sie, Immunantworten zu orchestrieren, indem sie Zytokine und Chemokine sezernieren und Antigene t-Zellen und B-Zellen präsentieren. Makrophagen spielen auch eine wichtige Rolle in zahlreichen anderen Prozessen, wie Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorgenese und Adipositas.

Um Nicht-Selbstmoleküle wie pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) und außerorts entfernte Moleküle wie schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) nachweisen zu können, sind Makrophagen mit einer Vielzahl von Mustererkennungsrezeptoren (PRR)ausgestattet 1. Leider macht dies auch Makrophagen besonders schwierig,um 2 zu transfekieren, da das Transfektionsreagenz3 und die transfizierten Nukleinsäuren4,5,6,7 oft von den PRRs als nicht selbst erkannt werden. Aus diesem Grund führt die Transfektion von Makrophagen mit chemischen oder physikalischen Methoden8 in der Regel zu Makrophagenaktivierung und Abbau der transfizierten Nukleinsäuren oder sogar zum Makrophagenselbstmord mittels Pyroptose, einer Form des programmierten lytischen Zelltodes, der nach Erkennung von zytosolischen PAMPs/DAMPs wie DNA oder Fremd-RNA9ausgelöst wird. Biologische Transfektion von Makrophagen mit Viren wie Adenoviren oder Lentiviren als Vektoren ist oft effizienter, aber die Konstruktion solcher viralen Vektoren ist zeitaufwändig und erfordert Biosicherheitsausrüstung der Stufe 210,11.

Obwohl Makrophagen intensiv erforscht werden, wird die Analyse ihrer Funktionen auf molekularer Ebene dadurch erschwert, dass eines der wichtigsten Instrumente der Molekularbiologie, die Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten zur exogenen Expression von Proteine, ist kaum anwendbar. Dies zwingt Forscher oft dazu, makrophagenähnliche Zelllinien anstelle von bona fide Makrophagen zu verwenden. Anwendungen für Nukleinsäurekonstrukttransfektion enzinieren die Expression mutierter oder getaggter Proteinversionen, die Überexpression eines bestimmten Proteins, die Proteinreexpression in einem entsprechenden Knockout-Hintergrund und die Expression von Proteinen anderer Arten (z. B. , Cre Recombinase oder Guide RNA und Cas9 für gezielte Gen Knockout).

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hocheffiziente Transfektion von (in der Regel schwer zu transfekten) primären Makrophagen ermöglicht, d. h. murinen peritonealen Makrophagen (PM) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) mit mRNA, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden. Wichtig ist, dass die mit diesem Protokoll erzeugte in vitro transkribierte mRNA die natürlich vorkommenden modifizierten Nukleoside nukleoside nucleosides 5-methyl-CTP und Pseudo-UTP enthält, die die Immunogenität reduzieren und dieStabilität4,6,7,12,13. Darüber hinaus werden die 5′-Enden der in vitro transkribierten mRNA durch antarktische Phosphatase dephosphoryliert, um die Erkennung durch den RIG-I-Komplex14,15zu verhindern. Dies minimiert die angeborene Immunerkennung der in vitro transkribierten mRNA. Mit unserem einfach durchzuführenden Protokoll werden Transfektionsraten zwischen 50-65% (Peritonealmakropages (PM)) und 85% (BMDM) erreicht, während, was wichtig ist, keine Zytotoxizität oder Immunogenität beobachtet wird. Wir beschreiben detailliert (i) wie die immunologisch stumme mRNA zur Transfektion aus DNA-Konstrukten wie Plasmiden und (ii) dem Transfektionsverfahren selbst erzeugt werden kann.

Protocol

Die Makrophagenisolierung von Mäusen erfolgte nach dem Tierschutzgesetz Deutschlands in Übereinstimmung mit der Ethikkommission der Universität Köln. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Handschuhen. Führen Sie alle Transfektionsschritte unter einer laminaren Durchflusshaube durch, um eine Kontamination der Zellen zu verhindern. Reinigen Sie vor der Arbeit mit mRNA alle Instrumente wie Pipetten und jede Oberfläche mit 70 % Ethanol und/oder einem RNAse-abbauenden Tensid…

Representative Results

Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um mRNA-Codierung für FLAG-markierte NEMO- und IKK-Varianten für die Transfektion von primären Makrophagen16zu generieren. Die Plasmide, die für FLAG-markierte Wildtyp (NEMOWT) und C54/347A mutierte NEMO (NEMOC54/374A) (siehe Materialtabelle) kodieren, enthalten bereits einen T7-Promotor in der richtigen Ausrichtung (Abbildung 1A</stron…

Discussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur hocheffizienten Transfektion von meist schwer transfekten primären Makrophagen mit in vitro transkribierter mRNA vor. Wichtig ist, dass die Transfektion der Makrophagen mit diesem Protokoll weder den Zelltod induziert noch die proinflammatorische Signalisierung aktiviert, was darauf hinweist, dass weder das Transfektionsreagenz noch die transfizierte mRNA als nicht-selbst erkannt werden.

Die Qualität der mRNA ist von zentraler Bedeutung für die erfolgreich…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670) unterstützt.

Materials

5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

References

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Cite This Article
Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

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