Summary

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Published: November 09, 2019
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Summary

Les macrophages, en particulier les macrophages primaires, sont difficiles à transfect car ils se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l’ARNm généré à partir de modèles d’ADN tels que les plasmides.

Abstract

Les macrophages sont des cellules phagocytiques spécialisées dans la détection de molécules non auto-d’origine. À cette fin, ils sont équipés d’un large éventail de récepteurs de reconnaissance de motifs (PrR). Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect que le réactif transfection et les acides nucléiques transfectés sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Par conséquent, la transfection entraîne souvent l’activation et la dégradation des acides nucléiques transfectés ou même le suicide des macrophages. Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires de murine tels que les macrophages péritonéaux (PM) et les macrophages marrow-dérivés de moelle (BMDM) avec ARNm in vitro transcrits des modèles d’ADN tels que des plasmides. Avec ce protocole simple, les taux de transfection d’environ 50-65% pour PM et environ 85% pour BMDM sont réalisés sans cytotoxicité ou immunogénicité observée. Nous décrivons en détail la génération de l’ARNm pour la transfection des constructions d’ADN telles que les plasmides et la procédure de transfection.

Introduction

Les macrophages sont des cellules phagocytiques qui se spécialisent dans la détection, l’ingestion et la dégradation des microbes, des cellules apoptotiques et des débris cellulaires. En outre, ils aident à orchestrer les réponses immunitaires en sécrétant des cytokines et des chemokines et en présentant des antigènes aux lymphocytes T et aux cellules B. Les macrophages jouent également un rôle important dans de nombreux autres processus, tels que la cicatrisation des plaies, l’athérosclérose, la tumorigénèse et l’obésité.

Pour être en mesure de détecter des molécules non autonomes telles que les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et les molécules hors de place telles que les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), les macrophages sont équipés d’un large éventail de récepteurs de reconnaissance de modèles (PRR)1. Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect2 que le réactif transfection3 et les acides nucléiques transfectés4,5,6,7sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Pour cette raison, la transfection des macrophages utilisant des méthodes chimiques ou physiques8 entraîne généralement l’activation et la dégradation des macrophages des acides nucléiques transfectés ou même dans le suicide par macrophage par pyroptose, une forme de mort cellulaire lytique programmée déclenchée après la reconnaissance des PAMP/DAMP cytosoliques tels que l’ADN ou l’ARN étranger9. La transfection biologique des macrophages à l’aide de virus tels que les adénovirus ou les lentivirus comme vecteurs est souvent plus efficace, mais la construction de tels vecteurs viraux prend beaucoup de temps et nécessite un équipement de niveau 2 de biosécurité10,11.

Ainsi, bien que les macrophages soient l’objet de recherches intensives, l’analyse de leurs fonctions au niveau moléculaire est entravée parce que l’un des outils les plus importants de la biologie moléculaire, la transfection des constructions d’acide nucléique pour l’expression exogène de protéines, n’est guère applicable. Cela oblige souvent les chercheurs à utiliser des lignées cellulaires semblables à des macrophages plutôt que des macrophages de bonne foi. Les applications pour la transfection de construction d’acide nucléique incluent l’expression des versions mutées ou marquées de protéine, la surexpression d’une protéine spécifique, la réexpression de protéine dans un fond askouteux respectif et l’expression des protéines d’autres espèces (par exemple. , Cre recombinase ou guide RNA et Cas9 pour le gène ko ciblé).

Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires (généralement difficiles à transfect), c’est-à-dire les macrophages péritonéaux de la murine (PM) et les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) avec l’ARNM généré à partir de modèles d’ADN tels que les plasmides. Fait important, l’ARNm transcrit in vitro généré à l’aide de ce protocole contient les nucléosides modifiés naturels 5-méthyl-CTP et pseudo-UTP qui réduisent l’immunogénicité et améliorent la stabilité4,6,7,12,13. En outre, les 5′-extrémités de l’ARNm transcrit in vitro sont déphosphorylées par la phosphatase antarctique pour empêcher la reconnaissance par le complexe RIG-I14,15. Ceci minimise la reconnaissance immunitaire innée de l’ARNm transcrit in vitro. Grâce à notre protocole facile à réaliser, les taux de transfection se siant entre 50 et 65 % (macrophages péritonéaux (PM)) et 85 % (BMDM) sont atteints alors que, ce qui est important, il n’y a pas de cytotoxicité ou d’immunogénicité observée. Nous décrivons en détail (i) comment l’ARNm immunologiquement réduit au silence pour la transfection peut être généré à partir de constructions d’ADN telles que les plasmides et (ii) la procédure de transfection elle-même.

Protocol

L’isolement des macrophages chez les souris a été effectué conformément à la loi allemande sur la protection des animaux, conformément au Comité d’éthique de l’Université de Cologne. REMARQUE: Effectuez toutes les étapes en portant des gants. Effectuer toutes les étapes de transfection sous une hotte à débit laminaire pour éviter la contamination des cellules. Avant de travailler avec l’ARNm, nettoyez tous les instruments tels que les pipettes et chaque surface a…

Representative Results

Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour générer un codage de l’ARNm pour les variantes NEMO et IKKMD étiquetées FLAG pour la transfection des macrophages primaires16. Les plasmides codants pour FLAG-tagged wild-type (NEMOWT) et C54/347A mutant NEMO (NEMOC54/374A) (voir le tableau des matériaux) contiennent déjà un promoteur T7 dans la bonne orientation (Figure 1A…

Discussion

Ici nous présentons un protocole pour la transfection très efficace des macrophages primaires habituellement difficiles-à-transfect avec l’ARNm transcrit in vitro. Fait important, la transfection des macrophages utilisant ce protocole n’induit pas la mort cellulaire ou n’active pas la signalisation proinflammatoire indiquant que ni le réactif transfection ni l’ARNm transfecté ne sont reconnus comme non-auto.

La qualité de l’ARNm est d’une importance capitale pour la transfection réussie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

References

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Cite This Article
Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

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