Summary

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Published: November 09, 2019
doi:

Summary

マクロファージ、特に一次マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化しているため、トランスフェクトに挑戦しています。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。

Abstract

マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化した貪食細胞です。この用に、それらはパターン認識受容体(PRR)の大きな配列を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬としてトランスフェクトに特に困難なマクロファージを作り、トランスフェクトされた核酸は、多くの場合、非自己としてPRRによって認識されます。したがって、トランスフェクションは、多くの場合、トランスファージの活性化とトランスフェクション核酸の分解、あるいはマクロファージの自殺をもたらす。ここでは、腹腹マクロファージ(PM)や骨髄由来マクロファージ(BMDM)などのマウス一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルを、プラスミドなどのDNAテンプレートから転写したmRNAを用いて説明する。この単純なプロトコルを使用すると、PMのトランスフェクション率は約50〜65%、BMDMのトランスフェクション率は、細胞傷害性または免疫原性が観察されずに達成される。プラスミドなどのDNA構築物からのトランスフェクションのためのmRNAの生成とトランスフェクション手順について詳しく説明する。

Introduction

マクロファージは、微生物、アポトーシス細胞、細胞破片の検出、摂取、分解に特化した貪食細胞です。さらに、サイトカインやケモカインを分泌し、T細胞やB細胞に抗原を提示することで免疫応答を調整するのに役立ちます。マクロファージはまた、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍形成および肥満のような他の多くのプロセスにおいて重要な役割を果たす。

病原体関連分子パターン(PAMP)や損傷関連分子パターン(DamP)などの場外分子などの非自己分子を検出できるように、マクロファージは、大きなパターン認識受容体(PRR)1を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬3およびトランスフェクト核酸4、5、6、7としてトランスフェクト2特に困難なマクロファージを作り、多くの場合、PrRによって非自己として認識される。このため、化学的または物理的方法8を用いたマクロファージのトランスフェクションは、通常、トランスフェクトされた核酸のマクロファージ活性化および分解、あるいはピロ球症を介したマクロファージ自殺においても、DNAまたは外来RNA9などのサイトソリックPamPs/Dammpの認識後に引き起こされるプログラムされた溶解細胞死の形態をもたらす。アデノウイルスやレンチウイルスなどのウイルスをベクターとして用いたマクロファージの生物学的トランスフェクションは、より効率的であることが多いが、そのようなウイルスベクターの構築には時間がかかり、バイオセーフティレベル2装置10、11を必要とする。

したがって、マクロファージは集中的な研究の対象であるが、分子生物学の最も重要なツールの一つである、発出性発現のための核酸構築物のトランスフェクションにより、分子レベルにおけるその機能の解析が妨げられる。タンパク質は、ほとんど適用できない。これはしばしば、研究者がボナ・フィデス・マクロファージではなくマクロファージ様細胞株を使用することを強制する。核酸構築トランスフェクションのアプリケーションには、変異またはタグ付けされたタンパク質バージョンの発現、特定のタンパク質の過剰発現、それぞれのノックアウトバックグラウンドでのタンパク質再発現および他の種からのタンパク質の発現(例えば.、クレリコンゲナーゼまたはガイドRNAおよびCas9を標的遺伝子ノックアウト用)。

ここでは、プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いたマウス腹蓋マクロファージ(PM)および骨髄由来マクロファージ(BMDM)である一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。重要なことに、このプロトコルを用いて生成されたインビトロ転写mRNAには、免疫原性を低下させ、安定性を高める天然の修飾ヌクレオシド5-メチル-CTPおよび擬似UTPが含まれており、安定性を高める4、6、7、12、13である。また、インビトロ転写mRNAの5’末端は、RIG-I複合体14、15による認識を防止するために南極ホスファターゼによって脱リン酸化される。これは、インビトロ転写mRNAの自然免疫認識を最小限に抑える。プロトコルを実行しやすいので、トランスフェクション率は50~65%(腹蓋マクロファージ(PM))~85%(BMDM)に達し、重要なことに、細胞傷害性や免疫原性は認められません。(i)トランスフェクション用の免疫学的に沈黙したmRNAが、プラスミドや(ii)トランスフェクション手順そのものなどのDNA構築物からどのように生成できるかを詳しく説明する。

Protocol

マウスからのマクロファージ分離は、ケルン大学の倫理委員会に準拠してドイツ動物保護法に従って行われた。 注:手袋を着用してすべてのステップを実行します。細胞の汚染を防ぐために、層流フードの下ですべてのトランスフェクションステップを実行します。mRNAを使用する前に、ピペットやすべての表面などのすべての機器を70%エタノールおよび/また…

Representative Results

このプロトコルを使用して、FLAG タグ付き NEMO および IKKβ バリアントの mRNA エンコーディングを生成し、一次マクロファージ16をトランスフェクションしました。FLAG タグ付きワイルドタイプ (NEMOWT)および C54/347A 変異型 NEMO (NEMOC54/374A)のプラスミドエンコーディング (材料表を参照) には、正しい向きの T7 プロモータが既?…

Discussion

ここでは、インビトロ転写mRNAを用いた通常はトランスフェクト性の高い一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションのためのプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルを用いたマクロファージのトランスフェクションは、細胞死を誘導したり、トランスフェクション試薬もトランスフェクトされたmRNAも非自己として認識されていないことを示す炎症シグナル伝?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品はドイツ・フォルシュチュングゲマイインシャフト(SFB 670)によって支えられた。

Materials

5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).

Play Video

Cite This Article
Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

View Video