フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定
Summary
提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。
Abstract
提示された方法またはわずかに変更されたバージョンは、臨床腫瘍学で使用される様々な抗癌治療の特定の治療応答および副作用を研究するために考案された。放射線療法や多数の抗がん剤によって引き起こされる、遺伝子毒性ストレス後のDNA損傷応答の定量的および縦方向の分析を可能にします。この方法は、DNA損傷応答のすべての段階をカバーし、DNA二本鎖切断(DSB)の誘導および修復、修復障害の場合のアポトーシスによる細胞周期停止および細胞死のエンドポイントを提供する。これらの測定値を組み合わせることで、細胞周期依存的な治療効果に関する情報が提供され、細胞増殖とDNA損傷に対する対処メカニズムの相互作用を詳細に研究することができます。化学療法剤や電位化放射線を含む多くのがん治療薬の効果は、特定の細胞周期相に応じて制限されるか、または強く変化するので、相関分析は、治療効果を評価するために堅牢で実行可能な方法に依存しています。細胞周期特異的な方法でDNAに。これは、シングルエンドポイントアッセイと提示された方法の重要な利点では不可能です。この方法は、任意の特定の細胞株に限定されず、腫瘍および正常組織細胞株の多数で徹底的にテストされている。環境リスク因子評価、薬物スクリーニング、腫瘍細胞における遺伝的不安定性の評価など、放射線腫瘍学以外の多くの分野で包括的な遺伝毒性アッセイとして広く応用できます。
Introduction
腫瘍学の目標は、正常な細胞に害を与えることなく、癌細胞を殺すか、または不活性化することです。多くの治療法は、がん細胞に遺伝子毒性ストレスを直接的または間接的に誘導するが、正常な細胞にも広がる治療法もある。化学療法または標的薬物は、照射された腫瘍1、2、3、4、5の放射線感受性を増強するために放射線療法と組み合わされることが多く、これは、正常な組織の損傷を最小にするために放射線量。
電化放射線および他の無毒剤は、塩基修飾、鎖架面および単一または二本鎖の破断を含む異なる種類のDNA損傷を誘発する。DNA二本鎖切断(DSB)は最も重篤なDNA病変であり、その誘導は放射線化学療法における電光放射線および様々な細胞静止薬の細胞殺傷効果の鍵である。DSBはゲノムの完全性を損なうだけでなく、突然変異6、7の形成を促進する。そのため、異なるDSB修復経路、およびアポトーシスのような回復不能な損傷を受けた細胞を排除するメカニズムが進化中に開発された。DNA損傷応答全体(DDR)は、DNA損傷認識および細胞周期停止から到達するシグナル伝達経路の複雑なネットワークによって調節され、DNA修復を可能にし、修復障害の場合にプログラムされた細胞死または不活性化に8。
提示されたフローサイトメトリック法は、DSB誘導および修復、ならびに修理失敗の結果をカバーする1つの包括的なアッセイで、ジェノト毒性ストレス後のDDRを調査するために開発されました。広く適用されたDSBマーカーγH2AXの測定と、古典的なsubG1分析とカスパーゼ-3活性化のより具体的な評価を用いて、細胞周期およびアポトーシスの誘導の分析を組み合わせた。
これらのエンドポイントを1つのアッセイで組み合わせることで、時間、労力、コストコストを削減できるだけでなく、DSB誘導および修復の細胞周期特異的測定、ならびにカスパーゼ-3活性化を可能にします。このような分析は、独立して行われるアッセイでは不可能ですが、毒性ストレス後のDNA損傷応答を包括的に理解するために非常に関連性が高い。細胞増殖性化合物などの多くの抗癌剤は、細胞分裂に対して向けられており、その効率は細胞周期段階に強く依存する。異なるDSB修復プロセスの可用性は、修復精度のために重要である細胞周期段階および経路選択にも依存し、順番にセル9、10、11の運命を決定する。 12.さらに、DSBレベルは、ジェノキシック化合物または放射線の線量だけでなく、細胞のDNA含有量にも依存するため、DSBレベルの細胞周期特異的測定はプール分析よりも正確です。
この方法は、神経膠芽腫13の抵抗機構を克服し、骨肉腫14、15における電離放射線と標的薬物との相互作用を解剖するために、異なる放射線療法の有効性を比較するために使用されてきた。および非定型奇形性ラブドイド癌16.さらに、記載された方法は、間葉系幹細胞17、18、19、20、21に対する無線および化学療法の副作用を分析するために広く使用されている。 22,23,24, 治療誘発正常組織損傷の修復に不可欠であり、再生医療に潜在的な応用を有する.
Protocol
1. 準備 任意のタイプの培養容器に≥1 x 105セル/サンプルを開始材料として調用します。 例えば、U87神経膠芽腫細胞を電分放射線に曝露した後の時間経過実験を行う:T25フラスコのサブコンフルエントU87細胞を各時間点に照射する。DSB修復(γH2AXレベル)と遅い時間ポイント(24時間から96時間まで)の動態に従って、残留DSBレベル、細胞周期効果およびアポトー?…
Representative Results
ヒトU87またはLN229神経膠芽腫細胞を4Gyのフォトンまたは炭素イオン放射で照射した。細胞周期特異的γH2AXレベルおよびアポトーシスは、ここに示す流れサイトメトリック法を用いて照射後48時間までの異なる時点で測定した(図3)。いずれの細胞株でも、炭素イオンは、同じ物理線量での光子放射と比較して、より低速に低下し、24~48時間で有意に上昇したγH2AXピークレベ?…
Discussion
注目の方法は使いやすく、二本鎖の破壊(DSB)誘導および修理、細胞周期の効果およびアポトーシス細胞死を含むDNA損傷応答の速く、正確で、再生可能な測定を提供する。これらのエンドポイントの組み合わせは、個々のアッセイよりも相互関係のより完全な画像を提供します。この方法は、放射線生物学、治療および保護の分野における包括的な遺伝毒性アッセイとして広く適用することが?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ドイツがん研究センター(DKFZ)のフローサイトメトリー施設チームの支援に感謝します。
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
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Cite This Article
Lopez Perez, R., Münz, F., Kroschke, J., Brauer, J., Nicolay, N. H., Huber, P. E. Cell Cycle-specific Measurement of γH2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (151), e59968, doi:10.3791/59968 (2019).