Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.
Die vorgestellte Methode oder leicht modifizierte Versionen wurden entwickelt, um spezifische Behandlungsreaktionen und Nebenwirkungen verschiedener Anti-Krebs-Behandlungen zu untersuchen, wie sie in der klinischen Onkologie verwendet werden. Es ermöglicht eine quantitative und Längsschnittanalyse der DNA-Schadensreaktion nach genotoxischem Stress, wie durch Strahlentherapie und eine Vielzahl von Anti-Krebs-Medikamenten induziert. Die Methode deckt alle Stadien der Reaktion auf DNA-Schäden ab und bietet Endpunkte für die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusstillstand und Zelltod durch Apoptose im Falle eines Reparaturfehlers. Die Kombination dieser Messungen liefert Informationen über zellzyklusabhängige Behandlungseffekte und ermöglicht somit eine eingehende Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Zellproliferation und Bewältigungsmechanismen gegen DNA-Schäden. Da die Wirkung vieler Krebstherapeutika, einschließlich Chemotherapeutika und ionisierender Strahlung, auf bestimmte Zellzyklusphasen begrenzt ist oder stark variiert, basieren korrelative Analysen auf einer robusten und praktikablen Methode zur Bewertung der Behandlungseffekte. auf die DNA in einer zellzyklusspezifischen Weise. Dies ist bei Single-Endpunkt-Assays und einem wichtigen Vorteil der vorgestellten Methode nicht möglich. Die Methode ist nicht auf eine bestimmte Zelllinie beschränkt und wurde gründlich in einer Vielzahl von Tumor- und normalen Gewebezelllinien getestet. Es kann weithin als umfassender Genotoxizitätstest in vielen Bereichen der Onkologie neben der Radioonkologie angewendet werden, einschließlich der Bewertung von Umweltrisikofaktoren, dem Arzneimittelscreening und der Bewertung genetischer Instabilität in Tumorzellen.
Das Ziel der Onkologie ist es, Krebszellen abzutöten oder zu inaktivieren, ohne normale Zellen zu schädigen. Viele Therapien induzieren direkt oder indirekt genotoxischen Stress in Krebszellen, aber auch zu einigen in normalen Zellen. Chemotherapie oder gezielte Medikamente werden oft mit Strahlentherapie kombiniert, um die Radiosensitivität des bestrahlten Tumors1,2,3,4,5zu verbessern, was eine die Strahlendosis, um normale Gewebeschäden zu minimieren.
Ionisierende Strahlung und andere genotoxische Mittel verursachen verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich Basismodifikationen, Strang-Querverbindungen und Ein- oder Zweistrangbrüche. DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind die schwerwiegendsten DNA-Läsionen und ihre Induktion ist der Schlüssel zur Zelltötungswirkung ionisierender Strahlung und verschiedener zytostatischer Medikamente in der Radiochemotherapie. DSBs schädigen nicht nur die Integrität des Genoms, sondern fördern auch die Bildung von Mutationen6,7. Daher haben sich während der Evolution verschiedene DSB-Reparaturpfade und Mechanismen zur Beseitigung irreparabel beschädigter Zellen wie Apoptose entwickelt. Die gesamte DNA-Schadensreaktion (DDR) wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalwegen reguliert, die von der ERKENNUNG von DNA-Schäden und dem Zellzyklusstillstand reichen, um eine DNA-Reparatur, einen programmierten Zelltod oder eine Inaktivierung im Falle eines Reparaturfehlers zu ermöglichen8.
Die vorgestellte zytometrische Strömungsmethode wurde entwickelt, um die DDR nach genotoxischem Stress in einem umfassenden Test zu untersuchen, der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers abdeckt. Es kombiniert die Messung des weit verbreiteten DSB-Markers H2AX mit der Analyse des Zellzyklus und der Induktion der Apoptose, mit klassischer SubG1-Analyse und einer spezifischeren Auswertung der Caspase-3-Aktivierung.
Die Kombination dieser Endpunkte in einem Test reduziert nicht nur Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand, sondern ermöglicht auch die zellzyklusspezifische Messung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Caspase-3-Aktivierung. Solche Analysen wären mit unabhängig durchgeführten Assays nicht möglich, aber sie sind für ein umfassendes Verständnis der REAKTION auf DNA-Schäden nach genotoxischem Stress von großer Bedeutung. Viele Krebsmedikamente, wie z. B. zytostatische Verbindungen, richten sich gegen die Zellteilung und ihre Effizienz ist stark vom Zellzyklusstadium abhängig. Die Verfügbarkeit verschiedener DSB-Reparaturprozesse hängt auch von der Zellzyklusstufe und der Fürdier-Genauigkeit entscheidenden Zellzyklusphase und -wegwahl ab und bestimmt wiederum das Schicksal der Zelle9,10,11, 12. Darüber hinaus ist die zellzyklusspezifische Messung des DSB-Spiegels genauer als die gepoolte Analyse, da die DSB-Spiegel nicht nur von der Dosis einer genotoxischen Verbindung oder Strahlung abhängen, sondern auch vom DNA-Gehalt der Zelle.
Die Methode wurde verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener Radiotherapien zu vergleichen, um Resistenzmechanismen bei Glioblastom13 zu überwinden und das Zusammenspiel zwischen ionisierender Strahlung und gezielten Medikamenten bei Osteosarkom14,15 zu sezieren. und atypische teraide Rhabdoidkrebs16. Darüber hinaus wurde die beschriebene Methode weit verbreitet, um Nebenwirkungen von Radio- und Chemotherapie auf mesenchymale Stammzellen17,18,19,20,21, 22,23,24, die für die Reparatur von behandlungsbedingten normalen Gewebeschäden unerlässlich sind und eine mögliche Anwendung in der regenerativen Medizin haben.
Die vorgestellte Methode ist einfach zu bedienen und bietet eine schnelle, genaue und reproduzierbare Messung der DNA-Schadensreaktion einschließlich Doppelstrangbruch (DSB) Induktion und Reparatur, Zellzykluseffekte und apoptotischezellige Tod. Die Kombination dieser Endpunkte bietet ein vollständigeres Bild ihrer Zusammenhänge als einzelne Assays. Die Methode kann in den Bereichen Strahlenbiologie, Therapie und Schutz und ganz allgemein in der Onkologie (z. B. für die Bewertung von Umweltrisikofaktoren, Arzneimitte…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Flow Cytometry Facility Team des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) für die Unterstützung.
1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Excel software | Microsoft | ||
FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
FlowJo v10 software | LLC | online order | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |