وتجمع الطريقة المعروضة بين التحليل الكمي لفواصل الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBs)، وتوزيع دورة الخلية والمبرمج لتمكين تقييم دورة الخلية الخاصة للحث DSB وإصلاح، فضلا عن عواقب فشل الإصلاح.
وقد وضعت طريقة المقدمة أو الإصدارات المعدلة قليلا لدراسة استجابات العلاج محددة والآثار الجانبية لمختلف العلاجات المضادة للسرطان كما تستخدم في الأورام السريرية. وهو يتيح إجراء تحليل كمي وطولي للاستجابة لأضرار الحمض النووي بعد الإجهاد السمية الجينية، كما يسببها العلاج الإشعاعي والعديد من الأدوية المضادة للسرطان. وتغطي هذه الطريقة جميع مراحل الاستجابة للتلف الحمض النووي، وتوفير نقاط النهاية للحث وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBs)، واعتقال دورة الخلية وموت الخلايا عن طريق المبرمج في حالة فشل الإصلاح. الجمع بين هذه القياسات يوفر معلومات عن آثار العلاج تعتمد على دورة الخلية، وبالتالي يسمح دراسة متعمقة للتفاعل بين الانتشار الخلوي وآليات المواجهة ضد تلف الحمض النووي. وبما أن تأثير العديد من علاجات السرطان بما في ذلك العوامل العلاجية الكيميائية والإشعاع المؤين يقتصر على مراحل دورة الخلايا المحددة أو يختلف بها بشدة، فإن التحليلات المترابطة تعتمد على طريقة قوية ومجدية لتقييم آثار العلاج على الحمض النووي بطريقة محددة دورة الخلية. هذا غير ممكن مع الاختبارات نقطة نهاية واحدة وميزة هامة من الأسلوب المقدم. لا تقتصر هذه الطريقة على أي خط خلية معين وقد تم اختبارها بدقة في العديد من خطوط الخلايا الورم ية وطبيعية الأنسجة. ويمكن تطبيقه على نطاق واسع كاختبار شامل للسمية الجينية في العديد من مجالات الأورام إلى جانب الأورام الإشعاعية، بما في ذلك تقييم عامل الخطر البيئي، وفحص الأدوية وتقييم عدم الاستقرار الوراثي في الخلايا السرطانية.
الهدف من الأورام هو قتل أو تعطيل الخلايا السرطانية دون الإضرار بالخلايا الطبيعية. العديد من العلاجات إما بشكل مباشر أو غير مباشر الحث على الإجهاد السمية الجينية في الخلايا السرطانية، ولكن أيضا إلى بعض تمتد في الخلايا الطبيعية. وغالبا ما يتم الجمع بين العلاج الكيميائي أو الأدوية المستهدفة معالعلاج الإشعاعي لتعزيز حساسية الإشعاع للورم المشع 1،2،3،4،5،مما يسمح للحد من الجرعة الإشعاعية لتقليل تلف الأنسجة الطبيعية.
ويسبب الإشعاع المؤين وغيره من العوامل السامة جينيا أنواعا مختلفة من تلف الحمض النووي، بما في ذلك التعديلات الأساسية، ووصلات حبلا متقاطعة، وفواصل أحادية أو مزدوجة. فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة (DSBs) هي آفات الحمض النووي الأكثر خطورة وتحريضها هو المفتاح لتأثير قتل الخلية من الإشعاع المؤين ومختلف الأدوية الخلوية في العلاج الكيميائي الإشعاعي. DSBs لا تضر فقط سلامة الجينوم، ولكن أيضا تعزيز تشكيل الطفرات6،7. لذلك، تطورت مسارات إصلاح DSB مختلفة، وآليات للقضاء على الخلايا التالفة التي لا يمكن إصلاحها مثل المبرمج خلال التطور. يتم تنظيم الاستجابة الكاملة للتلف الحمض النووي (DDR) من قبل شبكة معقدة من مسارات الإشارات التي تصل من التعرف على تلف الحمض النووي والقبض على دورة الخلية للسماح لإصلاح الحمض النووي، إلى موت الخلايا المبرمجة أو التعطيل في حالة فشل الإصلاح8.
وقد تم تطوير طريقة قياس التدفق المقدمة للتحقيق في نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج بعد الإجهاد السمية الجينية في فحص شامل واحد يغطي الحث وإصلاح DSB، فضلا عن عواقب فشل الإصلاح. فهو يجمع بين قياس علامة DSB تطبيقها على نطاق واسع γH2AX مع تحليل دورة الخلية وتحريض المبرمج، وذلك باستخدام التحليل subG1 الكلاسيكية وتقييم أكثر تحديدا من تنشيط caspase-3.
الجمع بين هذه النقاط النهائية في فحص واحد ليس فقط يقلل من الوقت والعمالة ونفقات التكلفة، ولكن أيضا تمكن قياس دورة محددة الخلية من الحث DSB وإصلاح، فضلا عن تنشيط caspase-3. ولن تكون هذه التحليلات ممكنة من خلال الاختبارات التي أجريت بشكل مستقل، ولكنها ذات صلة وثيقة بالفهم الشامل للاستجابة لأضرار الحمض النووي بعد الإجهاد السمية الجينية. العديد من الأدوية المضادة للسرطان، مثل المركبات الخلوية، موجهة ضد انقسام الخلايا وكفاءتها تعتمد بشدة على مرحلة دورة الخلية. كما يعتمد توافر عمليات إصلاح DSB المختلفة على مرحلة دورة الخلية واختيار المسار وهو أمر بالغ الأهمية لدقة الإصلاح، وبدوره يحدد مصير الخلية9،10،11، 12. وبالإضافة إلى ذلك، فإن قياس مستويات DSB الخاص بدورة الخلايا أكثر دقة من التحليل المجمع، لأن مستويات DSB لا تعتمد فقط على جرعة مركب أو إشعاع سام جينياً، بل تعتمد أيضاً على محتوى الحمض النووي للخلية.
وقد استخدمت هذه الطريقة لمقارنة فعالية العلاجات الإشعاعية المختلفة للتغلب على آليات المقاومة في الورم الأرومي الدبقي13 وتشريح التفاعل بين الإشعاع المؤين والأدوية المستهدفة في الساركوما العظمية14،15 وسرطان الرعبدات غير النمطية التيرتويد16. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام الطريقة الموصوفة على نطاق واسع لتحليل الآثار الجانبية للراديو والعلاج الكيميائي على الخلايا الجذعية mesenchymal17،18،19،20،21، 22،23،24، والتي هي ضرورية لإصلاح تلف الأنسجة الطبيعية الناجمة عن العلاج ولها تطبيق محتمل في الطب التجديدي.
طريقة مميزة سهلة الاستخدام، ويقدم قياس سريع ودقيق واستنساخ استجابة الضرر الحمض النووي بما في ذلك كسر حبلا مزدوجة (DSB) التعريفي وإصلاح، وآثار دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج. ويوفر الجمع بين نقاط النهاية هذه صورة أكمل لعلاقاتها المتبادلة من الاختبارات الفردية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على…
The authors have nothing to disclose.
نشكر فريق مرفق قياس التدفق في المركز الألماني لبحوث السرطان (DKFZ) على دعمهم.
1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Excel software | Microsoft | ||
FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
FlowJo v10 software | LLC | online order | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |