Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.
La inmunoterapia adoptiva es prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas. Describimos un enfoque simple para transducir células T humanas primarias con receptor de antígeno quimérico (CAR) y expandir su progenie ex vivo. Incluimos ensayos para medir la expresión CAR, así como la diferenciación, la capacidad proliferativa y la actividad citolítica. Describimos ensayos para medir la producción de citoquinas efector y la secreción inflamatoria de citoquinas en células CAR T. Nuestro enfoque proporciona un método fiable y completo para el cultivo de células T CAR para modelos preclínicos de inmunoterapia adoptiva.
Los receptores de antígeno quimérico (CAR) proporcionan un enfoque prometedor para redirigir las células T contra antígenos tumorales distintos. Los CAR son receptores sintéticos que unen un objetivo de antígeno. Aunque su composición precisa es variable, los RCA generalmente contienen 3 dominios distintos. El dominio extracelular dirige la unión a un antígeno objetivo y normalmente se compone de un fragmento de anticuerpo de cadena única vinculado a la CAR a través de una bisagra extracelular. El segundo dominio, comúnmente derivado de la cadena CD3 del complejo del receptor de células T (TCR), promueve la activación de la célula T después de la participación de la CAR. Un tercer dominio coestimulante se incluye para mejorar la función de las células T, injerto, metabolismo, y la persistencia. El éxito de la terapia con células T CAR en diversas neoplasias malignas hematopoyéticas incluyendo leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y mieloma múltiple pone de relieve la promesa terapéutica de este enfoque1,2,3,4,5,6. Las recientes aprobaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para dos terapias de células T CAR específicas de CD19, tisagenlecleucel para ADULTOs pediátricos y jóvenes adultos ALL y axicabtagene ciloleucel para linfoma difuso de células B grandes, refuerza el mérito traslacional de la Terapia de células T CAR.
Los enfoques basados en T DE CAR implican el aislamiento de los glóbulos T de la sangre periférica, la activación, la modificación genética y la expansión ex vivo. La diferenciación es un parámetro importante que regula la eficacia de las células T de la CAR. En consecuencia, la restricción de la diferenciación de células T durante el cultivo ex vivo mejora la capacidad del producto infundido para injertar, expandir y persistir, proporcionando inmunovigilancia a largo plazo después de la transferencia adoptiva2,7,8,9. Las células T consisten en varios subconjuntos distintos, incluyendo: células T ingenuas (Tn), memoria central (Tcm), memoria del efector (Tem), efector diferenciado (Tte) y memoria de células madre (Tscm). Los células T diferenciadas por efector tienen una potente capacidad citolítica; sin embargo, son de corta duración y injertan mal10,11,12. Por el contrario, las células T con un fenotipo menos diferenciado, incluidas las células T ingenuas y Tcm, presentan capacidades superiores de injerto y proliferación tras la transferencia celular adoptiva13,14,15,16,17,18. La composición de las células T recogidas en el producto prefabricado puede variar entre los pacientes y se correlaciona con el potencial terapéutico de las células T CAR. La proporción de células T con un inmunofenotipo de forma ingenua en el producto de aféresis inicial está altamente correlacionada con el injerto y la respuesta clínica19.
La duración del cultivo es un parámetro importante que influye en la diferenciación en las células T CAR preparadas para la transferencia adoptiva. Recientemente desarrollamos un enfoque para generar células T CAR de calidad superior utilizando un paradigma de cultivo abreviado20. Utilizando nuestro enfoque, mostramos que el cultivo limitado da lugar a células T CAR con función efectora superior y persistencia después de la transferencia adoptiva en modelos de xenoinjerto de leucemia. Aquí, presentamos los enfoques para generar confiablemente células CART19 (células T autólogas diseñadas para expresar scFv anti-CD19 conectados a CD3 y los dominios de señalización 4-1BB) e incluir una descripción detallada de los ensayos que proporcionan información sobre la bioactividad y eficacia de CAR T antes de la transferencia adoptiva.
Aquí describimos enfoques para medir la función y eficacia de las células T CAR cosechadas a intervalos variables a lo largo del cultivo ex vivo. Nuestros métodos proporcionan una visión completa de los ensayos diseñados para evaluar la capacidad proliferativa, así como la función del efector in vitro. Describimos cómo medir la actividad de los linfocitos T después de la estimulación a través de la CAR y los modelos de xenoinjerto de detalle de la leucemia utilizando células T CAR cosechadas en el día 3 fre…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte a través de fondos proporcionados por Novartis Pharmaceuticals a través de una alianza de investigación con la Universidad de Pensilvania (Michael C. Milone) así como el Premio Académico de la Fundación St. Baldrick (Saba Ghassemi).
Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |