우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.
입양 면역 요법은 암과 전염병의 치료에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 우리는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 가진 1 차적인 인간 T 세포를 변환하고 그들의 자손 ex vivo를 확장하는 간단한 접근을 기술합니다. 우리는 CAR 발현뿐만 아니라 분화, 증식 능력 및 세포 분석 활성을 측정하는 분석방법을 포함한다. 우리는 CAR T 세포에서 이펙터 사이토카인 생산 및 염증성 사이토카인 분비를 측정하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 입양 면역 요법의 전임상 모형을 위한 CAR T 세포를 배양하기 위하여 믿을 수 있고 포괄적인 방법을 제공합니다.
키메라 항원 수용체 (CA)는 명백한 종양 항원에 대하여 T 세포를 리디렉션하는 유망한 접근을 제공합니다. CAR은 항원 표적을 결합하는 합성 수용체입니다. 정확한 컴포지션은 가변이지만 CA는 일반적으로 3개의 고유한 도메인을 포함합니다. 세포외 도메인은 표적 항원과 결합하는 것을 지시하며 전형적으로 세포외 힌지를 통해 CAR에 연결된 단일 사슬 항체 단편으로 구성된다. 제2 도메인은, 일반적으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 CD3θ 사슬로부터 유래되고, CAR 결합 후 T 세포 활성화를 촉진한다. 세 번째 costimultory 도메인 T 세포 기능을 향상 시키기 위해 포함, 생착, 물질 대사, 그리고 지 속성. B세포 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 다발성 골수종을 포함한 다양한 조혈 악성종양에서 CAR T 세포 치료의 성공은 이 접근법의 치료 적 약속을강조한다 1,2,3,4,5,6. 최근 식품의약국(FDA)은 2개의 CD19 특이적 CAR T 세포 치료제, 소아 및 젊은 성인을 위한 티사겐클레우셀 및 확산대형 B세포 림프종에 대한 액시카브타진 실롤루셀에 대한 승인을 통해 CAR T 세포 치료의 번역 장점을 강화합니다.
CAR T-기반 접근법은 말초 혈액으로부터 T 세포의 분리, 활성화, 유전자 변형, 및 확장 ex vivo를 포함한다. 분화는 CAR T 세포 효능을 조절하는 중요한 파라미터이다. 이에 따라, 생체 배양 시 T 세포 분화를 제한하면 주입된 생성물이 이식, 팽창 및 지속하는 능력을 향상시키고, 입양 전달2,7,8,9에이어 장기적인 면역감시를 제공한다. T 세포는 순진한 T 세포 (Tn), 중앙 기억 (Tcm), 이펙터 메모리 (Tem), 이펙터 분화 (Tte) 및 줄기 세포 메모리 (Tscm)를 포함하는 몇몇 명백한 부체로 이루어져 있습니다. 이펙터 분화 T 세포는 강력한 세포 용해 능력을 갖는다; 그러나, 그들은 짧은 수명과 제대로생착10,11,12. 대조적으로, 순진한 T 세포 및 Tcm을 포함하는 덜 분화된 표현형을 가진 T 세포는 입양세포 전이13,14,15,16,17, 18에이어 우수한 생착 및 증식능력을 나타낸다. 미리 제조된 제품에서 수집된 T 세포의 조성은 환자에 따라 달라질 수 있으며 CAR T 세포의 치료 전위와 상관관계가 있다. 시작 apheresis 생성물에서 순진한 유사 면역 표현형을 가진 T 세포의 비율은 생착 및 임상 반응 둘 다와 높게 상관관계가 있습니다19.
배양 기간은 입양 전달을 위해 제조된 CAR T 세포에서분화에 영향을 미치는 중요한 파라미터이다. 최근 약어 배양 패러다임20을이용하여 우수한 품질의 CAR T 세포를 생성하는 접근법을 개발하였다. 우리의 접근을 사용하여, 우리는 제한된 문화가 백혈병의 이종이식 모형에 있는 채택적인 전송 다음 우수한 이펙터 기능 및 지속성을 가진 CAR T 세포를 초래한다는 것을 보여주었습니다. 여기서, 우리는 CART19 세포(CD3θ 및 4-1BB 신호 전달 도메인에 부착된 항 CD19 scFv를 발현하도록 설계된 자가 T 세포)를 안정적으로 생성하는 접근법을 제시하고, 입양 전적 전에 CAR T 생체 활성 및 효능에 대한 통찰력을 제공하는 검소에 대한 상세한 설명을 포함한다.
여기에서 우리는 ex vivo 배양전반에 걸쳐 다양한 간격으로 수확된 CAR T 세포의 기능 및 효능을 측정하는 접근법을 기술한다. 우리의 방법은 시험관내 이펙터 기능뿐만 아니라 증식 능력을 평가하기 위해 고안된 계산에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 CAR를 통해 자극 다음 CAR T 세포 활동을 측정하는 방법을 설명하고 그들의 로그 방출 단계의 3 대 9 일째에 수확 된 CAR T 세포를 사용하여 …
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 펜실베니아 대학과 연구 동맹을 통해 노바티스 제약에 의해 제공 된 자금을 통해 부분적으로 지원되었다 (마이클 C. 밀론) 뿐만 아니라 세인트 볼드릭의 재단 학자 상 (사바 가세미).
Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |