Summary

Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

Published: December 17, 2019
doi:

Summary

Descriviamo un approccio per generare in modo affidabile le cellule T del recettore dell’antigene chimerico (CAR) e testare la loro differenziazione e funzione in vitro e in vivo.

Abstract

L’immunoterapia adottiva promette per il trattamento del cancro e delle malattie infettive. Descriviamo un semplice approccio per trasdurre le cellule T umane primarie con il recettore dell’antigene chimerico (CAR) ed espandere la loro progenie ex vivo. Includiamo saggi per misurare l’espressione CAR, nonché la differenziazione, la capacità proliferare e l’attività citolitica. Descriviamo i saggi per misurare la produzione di citochine e la secrezione infiammatoria di citochina nelle cellule CAR T. Il nostro approccio fornisce un metodo affidabile e completo per la coltura delle cellule T CAR per modelli preclinici di immunoterapia adottiva.

Introduction

I recettori degli antigeni chimerici (CAT) forniscono un approccio promettente per reindirizzare le cellule T contro antigeni tumorali distinti. I CR sono recettori sintetici che legano un bersaglio dell’antigene. Mentre la loro composizione precisa è variabile, i CAR contengono generalmente 3 domini distinti. Il dominio extracellulare dirige il legame verso un antigene bersaglio ed è in genere costituito da un frammento di anticorpo a catena singola collegato alla CAR tramite una cerniera extracellulare. Il secondo dominio, comunemente derivato dalla catena CD3 del complesso del recettore delle cellule T (TCR), promuove l’attivazione delle cellule T in seguito al coinvolgimento della CAR. Un terzo dominio costimulatory è incluso per migliorare la funzione delle cellule T, innesto, metabolismo, e la persistenza. Il successo della terapia cellulare CAR T in varie neoplasie ematopoietiche tra cui la leucemia linfoblastica acuta a cellule B (ALL), la leucemia linfocitica cronica (CLL) e il mieloma multiplo evidenziano la promessa terapeutica di questo approccio1,2,3,4,5. Le recenti approvazioni della Food and Drug Administration (FDA) per due terapie cellulari CAR T specifiche per CD19, tisagenlecleucel per bambini e giovani adulti ALL e axicabtagene ciloleucel per il linfoma diffuso a grandi cellule B, rafforza il merito traslazionale della terapia cellulare CAR T.

Gli approcci basati su CAR T prevedono l’isolamento delle cellule T dal sangue periferico, l’attivazione, la modificazione genetica e l’espansione ex vivo. La differenziazione è un parametro importante che regola l’efficacia delle cellule CAR T. Di conseguenza, limitare la differenziazione delle cellule T durante la coltura ex vivo migliora la capacità del prodotto infuso di innestare, espandere e persistere, fornendo un’immunosorveglianza a lungo termine dopo il trasferimento adottivo2,7,8,9. Le cellule T sono costituite da diversi sottoinsiemi distinti, tra cui: cellule T ingenue (Tn), memoria centrale (Tcm), memoria efsiatrice (Tem), effettore differenziato (Tte) e memoria delle cellule staminali (Tscm). Le cellule T differenziate dell’effetto hanno una potente capacità citolitica; tuttavia, sono di breve durata e ne innestano male10,11,12. Al contrario, le cellule T con un fenotipo meno differenziato, comprese le cellule T ingenue e Tcm, presentano capacità di innesto e proliferazione superiori dopo il trasferimento delle cellule adottive13,14,15,16,17,18. La composizione delle cellule T raccolte nel prodotto prefabbricato può variare tra i pazienti e correlata al potenziale terapeutico delle cellule T CAR. La proporzione di cellule T con un immunofenotipo ingenuo nel prodotto dell’aferesi iniziale è altamente correlata sia con l’innesto che con la risposta clinica19.

La durata della coltura è un parametro importante che influenza la differenziazione nelle cellule T CAR preparate per il trasferimento adottivo. Recentemente abbiamo sviluppato un approccio per generare cellule CAR T di qualità superiore utilizzando un paradigma di coltura abbreviato20. Utilizzando il nostro approccio, abbiamo dimostrato che una cultura limitata dà origine a cellule CAR T con funzione efsiatrice superiore e persistenza dopo il trasferimento adottivo in modelli di xenotrapianto di leucemia. Qui presentiamo gli approcci per generare in modo affidabile cellule CART19 (cellule T autologhe progettate per esprimere anti-CD19 scFv collegate al CD3 e ai domini di segnalazione 4-1BB) e includiamo una descrizione dettagliata dei saggi che forniscono informazioni sulla bioattività e sull’efficacia di CAR T prima del trasferimento adottivo.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono approvati dal Comitato Istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università della Pennsylvania. 1. Attivazione, trasduzione ed espansione delle cellule T Attivare le cellule T umane primarie fresche o crioconservate mescolando con perline magnetiche anti CD3/CD28 (ad esempio, dinaline) a un rapporto di 3 perline per cellula T in piatti di coltura cellulare a 6 pozzetti. Cellule T di coltura nel mezzo X-VIVO 15 integrate con 5% siero uman…

Representative Results

Utilizzando i metodi descritti sopra, abbiamo stimolato e ampliato le cellule T per 3 o 9 giorni (Figura 1A,B). Abbiamo anche analizzato il loro profilo di differenziazione, come indicato dalla strategia di gating delineata nella Figura 1C, misurando l’abbondanza di glicoproteine distinte espresse sulla superficie cellulare. Mostriamo un progressivo spostamento verso la differenziazione degli effetti nel tempo durante la cultura…

Discussion

Qui descriviamo gli approcci per misurare la funzione e l’efficacia delle cellule CAR T raccolte a intervalli variabili in tutta la coltura ex vivo. I nostri metodi forniscono una visione completa dei saggi progettati per valutare la capacità proliferaria e la funzione degli effetti in vitro. Descriviamo come misurare l’attività delle cellule CAR T dopo la stimolazione attraverso la CAR e i modelli di xenotrapianto dettagliati della leucemia utilizzando cellule CAR T raccolte al giorno 3 contro il giorno 9 della loro f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il finanziamento fornito da Novartis Pharmaceuticals attraverso un’alleanza di ricerca con l’Università della Pennsylvania (Michael C. Milone) e il premio St. Baldrick’s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Materials

Anti CD3/CD28 dynabeads Thermo Fisher 40203D
APC Mouse Anti-Human CD8 BD Biosciences 555369 RRID:AB_398595
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD Biosciences 560179 RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate BD Biosciences 349202
BD Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody BioLegend 317444 RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend 317322 RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Life Technolohgies C34554
CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen C36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody BD Pharmingen 561271 RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4 BD Biosciences 555346 RRID:AB_395751
HEPES Gibco 15630-080
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Human IL-2 IS, premium grade Miltenyi 130-097-744
L-glutamine Gibco 28030-081
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux Perkin Elmer
LIVE/DEAD Fixable Violet Molecular Probes L34964
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter
Na251CrO4 Perkin Elmer NEZ030S001MC
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody BioLegend 325616 RRID:AB_830689
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody BioLegend 302223
PE anti-human CD45RO Antibody BD Biosciences 555493 RRID:AB_395884
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody BioLegend 305610 RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody Beckman Coulter A54823
Phenol red-free medium Gibco 10373-017
UltraPure SDS Solution, 10% Invitrogen 15553027
Via-Probe BD Biosciences 555815
X-VIVO 15 Gibco 04-418Q
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Perkin Elmer 122799

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Cite This Article
Ghassemi, S., Milone, M. C. Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy. J. Vis. Exp. (154), e59949, doi:10.3791/59949 (2019).

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