Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.
A imunoterapia adotiva é promissora para o tratamento do câncer e das doenças infecciosas. Descrevemos uma abordagem simples para transduzir as células T humanas primárias com receptor de antígeno quimérico (CAR) e expandir sua progênie ex vivo. Incluímos ensaios para medir a expressão do CAR, bem como diferenciação, capacidade proliferativa e atividade citolítica. Descrevemos ensaios para medir a produção de citocina efetoee e secreção inflamatória de citocina em células T CAR. Nossa abordagem fornece um método confiável e abrangente para a cultura das células T CAR para modelos pré-clínicos de imunoterapia adotiva.
Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) fornecem uma abordagem promissora para redirecionar as células T contra antígenos tumorais distintos. Cars são receptores sintéticos que ligam um alvo de antígeno. Embora sua composição precisa seja variável, os CARs geralmente contêm 3 domínios distintos. O domínio extracelular direciona a ligação a um antígeno alvo e normalmente é composto por um único fragmento de anticorpo de cadeia ligado ao CAR através de uma dobradiça extracelular. O segundo domínio, comumente derivado da cadeia CD3 do complexo do receptor de células T (TCR), promove a ativação de células T após o engajamento da RCA. Um terceiro domínio costimulatory é incluído para realçar a função da pilha de T, engraftment, metabolismo, e persistência. O sucesso da terapia com células T CAR em várias neoplasias hematopoiéticas, incluindo leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células B, leucemia linfocítica crônica (LlCa) e mieloma múltiplo destaca a promessa terapêutica desta abordagem1,2,3,4,5,6. As recentes aprovações da Food and Drug Administration (FDA) para duas terapias específicas de células T car específicas para CD19, tisagenlecleucel para TODOS pediátricos e adultos jovens e ciloleucel axicabtagene para linfoma difuso de grandes células B, reforça o mérito translacional da terapia de células T CAR.
As abordagens baseadas em CAR envolvem o isolamento das células T do sangue periférico, ativação, modificação genética e expansão ex vivo. A diferenciação é um parâmetro importante que regula a eficácia das células T do CAR. Assim, restringir a diferenciação de células T durante a cultura ex vivo aumenta a capacidade do produto infundido de enxertar, expandir e persistir, fornecendo imunovigilância de longo prazo após transferência adotiva2,7,8,9. As células T consistem em vários subconjuntos distintos, incluindo: células T ingênuas (Tn), memória central (Tcm), memória efeora (Tem), efecionista diferenciada (Tte) e memória de células-tronco (Tscm). As células T diferenciadas effector têm potente capacidade ctolítica; no entanto, eles são de curta duração e enxerto mal10,11,12. Em contraste, as células T com um fenótipo menos diferenciado, incluindo células T ingênuas e Tcm exibem enxerto superior e habilidades proliferativas após transferência de células adotivas13,14,15,16,17, 18. A composição das células T coletadas no produto pré-fabricado pode variar entre os pacientes e se correlaciona com o potencial terapêutico das células T CAR. A proporção de células T com um imunofenótipo ingênuo no produto de áherese inicial está altamente correlacionada com o enxerto e a resposta clínica19.
A duração da cultura é um parâmetro importante que influencia a diferenciação nas células T car preparadas para transferência adotiva. Recentemente desenvolvemos uma abordagem para gerar células T CAR de qualidade superior usando um paradigma de cultura abreviado20. Usando nossa abordagem, mostramos que a cultura limitada dá origem a células T CAR com função efetiva superior e persistência após transferência adotiva em modelos de xenoenxerto de leucemia. Aqui, apresentamos as abordagens para gerar de forma confiável as células CART19 (células T autólogas projetadas para expressar scFv anti-CD19 anexadas ao CD3 e os domínios de sinalização 4-1BB) e incluímos uma descrição detalhada dos ensaios que fornecem informações sobre a bioatividade e eficácia do CAR T antes da transferência adotada.
Aqui descrevemos abordagens para medir a função e eficácia das células T CAR colhidas em intervalos variados ao longo da cultura ex vivo. Nossos métodos fornecem uma visão abrangente sobre ensaios projetados para avaliar a capacidade proliferativa, bem como a função efetiva in vitro. Descrevemos como medir a atividade das células T car após a estimulação através do CAR e detalhar os modelos de xenoenxerto de leucemia usando células T CAR colhidas no dia 3 vs dia 9 de sua fase de expansão logarítica.
<…The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte através do financiamento fornecido pela Novartis Pharmaceuticals através de uma aliança de pesquisa com a Universidade da Pensilvânia (Michael C. Milone), bem como st. Baldrick’s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |