Medición de la proliferación de células musculares lisas vasculares mediante la química de clics
Summary
La proliferación es una parte crítica de la función celular, y una lectura común utilizada para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Por lo tanto, la medición de la proliferación es un ensayo frecuentemente utilizado en la biología celular. Aquí presentamos un método simple y versátil de medición de la proliferación que se puede utilizar en células adherentes y no adherentes.
Abstract
La capacidad de una célula para proliferar es integral a la función normal de la mayoría de las células, y la desregulación de la proliferación está en el corazón de muchos procesos de la enfermedad. Por estas razones, la medición de la proliferación es una herramienta común utilizada para evaluar la función celular. La proliferación celular se puede medir simplemente contando; sin embargo, se trata de un medio indirecto para medir la proliferación. Un medio común de detectar directamente las células que se preparan para dividir es mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Estos incluyen el nucleósido radioactivo analógico 3H-timidina más análogos nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2′ deoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiuridina (EdU). La incorporación de EdU se detecta por química de clic, que tiene varias ventajas en comparación con BrdU. En este informe, proporcionamos un protocolo para medir la proliferación mediante la incorporación de EdU. Este protocolo incluye opciones para varias lecturas, junto con las ventajas y desventajas de cada una. También discutimos los lugares donde el protocolo se puede optimizar o modificar para satisfacer las necesidades específicas del experimento planeado. Por último, tocamos las formas en que este protocolo básico se puede modificar para medir otros metabolitos celulares.
Introduction
La proliferación es una parte crítica de la función celular1,2. El control de la proliferación influye en procesos normales como el desarrollo y en procesos patológicos como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares. El crecimiento hiperplástico de las células musculares lisas vasculares, por ejemplo, se cree que es un precursor de la aterosclerosis3. Los cambios en la proliferación celular también se utilizan para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Dado su impacto generalizado, la medición de la proliferación es un pilar de muchos laboratorios basados en la biología celular.
La proliferación celular se puede medir simplemente contando las células si la población celular de interés se divide con bastante rapidez. Para las células de crecimiento más lento, el recuento de células puede ser menos sensible. La proliferación se mide a menudo mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Aunque el estándar de oro es la incorporación de 3H-timidina, muchos laboratorios están alejándose de este método dada la disponibilidad de alternativas más nuevas y no radiactivas. Estos incluyen colorantes fluorescentes citoplasmáticos, detección de proteínas asociadas al ciclo celular, y la incorporación de análogos de nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2′ desoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiruridina (EdU)4.
Los tintes citoplásmicos, como el éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), detectan la proliferación porque la intensidad del tinte se reduce a la mitad cada vez que la célula divide5. Esta técnica se utiliza comúnmente en la citometría de flujo para células no adherentes. No se ha utilizado mucho para células adherentes, pero con la nueva generación de lectores de placas de imágenes esto puede cambiar. La detección de proteínas asociadas al ciclo celular a través de técnicas basadas en anticuerpos (citometría de flujo, inmunohistoquímica, etc.) se utiliza a menudo para tejidos o células no adherentes. Estas células/tejidos deben ser fijados y permeabilizados antes de la tinción. Los análogos de nucleósidoBrdU y EdU son similares en enfoque a 3H-timidina, pero sin el inconveniente de la radiactividad. La incorporación de BrdU se detecta mediante anticuerpos anti-BrdU, y por lo tanto las células deben ser fijas y permeabilizadas antes de la tinción. Además, las células deben tratarse con DNase para exponer el epítopo de BrdU.
La incorporación de EdU se detecta mediante la química de clics, en la que los grupos de alquino y azida “hacen clic” juntos en presencia de cobre catalítico. Cualquiera de los grupos puede servir como molécula biosintéticamente incorporada o molécula de detección4. Los análogos de nucleósidos disponibles comercialmente tienen el grupo alquino unido. Para los ensayos de proliferación, por lo tanto, el análogo de nucleósido salyne funcionalizado es detectado por un azida conjugada con un tinte fluorescente u otro marcador. La incorporación de EdU tiene varias ventajas sobre BrdU. En primer lugar, debido a que los grupos de alquino y azida no se encuentran en las células de mamíferos, esta interacción es muy específica con un fondo bajo6. Debido a que ambos grupos son pequeños, las células no necesitan someterse a la desnaturalización del ADN para exponer el análogo de nucleósido como se requiere para BrdU7. Por último, la química del clic es muy versátil, y se puede utilizar para el etiquetado metabólico de ADN, ARN, proteínas, ácidos grasos, y carbohidratos8,9,10,11. Si el objetivo metabólicamente etiquetado de interés está en la superficie celular, las células vivas se pueden etiquetar12. Además, las células se pueden procesar para la tinción inmunofluorescente con anticuerpos.
El siguiente protocolo describe el uso de la incorporación de EdU y la química de clic para medir la proliferación en células musculares lisas vasculares humanas(Figura 1). Mostramos tres formas diferentes de medir la incorporación de EdU, resultados representativos de cada uno, y sus ventajas y desventajas. La medición de la proliferación a través de la química de clics es particularmente útil para las células de crecimiento adherente y más lentas. Además, la morfología de la célula está bien mantenida y también se puede realizar la tinción basada en anticuerpos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La incorporación de EdU es una forma sencilla y directa de medir la proliferación celular; es particularmente útil para las células adherentes13. Nuestro protocolo utiliza células musculares lisas, pero es aplicable a cualquier célula adherente (epitelial, endotelial, etc.). Aunque el protocolo no es complicado, el único paso crítico es hacer que la solución de etiquetado sea: los ingredientes deben agregarse en el orden indicado. Además, al igual que las manchas occidentales quimiolumin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Katie Carroll por la asistencia técnica. También damos las gracias al Dr. David Cool y al Laboratorio de Análisis de Proteómica por la instrucción y el suministro del lector de placas de imágenes Cytation. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Estatal Wright (a L.E.W.).
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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