Messung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen mit Hilfe der Klickchemie
Summary
Proliferation ist ein kritischer Teil der zellulären Funktion, und eine gemeinsame Auslesung verwendet, um potenzielle Toxizität von neuen Medikamenten zu bewerten. Die Messung der Proliferation ist daher ein häufig verwendeter Assay in der Zellbiologie. Hier präsentieren wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung der Proliferation, die in haftenden und nicht haftenden Zellen eingesetzt werden kann.
Abstract
Die Fähigkeit einer Zelle, sich zu vermehren, ist integraler Bestandteil der normalen Funktion der meisten Zellen, und dysregulation der Proliferation ist das Herzstück vieler Krankheitsprozesse. Aus diesen Gründen ist die Messung der Proliferation ein gängiges Werkzeug zur Bewertung der Zellfunktion. Die Zellproliferation kann einfach durch Zählen gemessen werden; dies ist jedoch ein indirektes Mittel zur Messung der Proliferation. Ein gängiges Mittel zur direkten Erkennung von Zellen, die sich auf die Teilung vorbereiten, ist die Einbindung von markierten Nukleosidanalogien. Dazu gehören das radioaktive Nukleosid-Analog3 H-Thymidin plus nicht-radioaktive Nukleosid-Analoga wie 5-Brom-2′-Deoxyuridin (BrdU) und 5-Ethynyl-2-Deoxyuridin (EdU). Die Einbindung von EdU wird durch Klickchemie erkannt, die im Vergleich zu BrdU mehrere Vorteile hat. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll zur Messung der Proliferation durch die Einbeziehung von EdU zur Verfügung. Dieses Protokoll enthält Optionen für verschiedene Auslesungen, zusammen mit den Vor- und Nachteilen der einzelnen. Wir diskutieren auch Orte, an denen das Protokoll optimiert oder geändert werden kann, um den spezifischen Anforderungen des geplanten Experiments gerecht zu werden. Schließlich berühren wir die Möglichkeiten, wie dieses Basisprotokoll zur Messung anderer Zellmetaboliten geändert werden kann.
Introduction
Proliferation ist ein kritischer Teil der Zellfunktion1,2. Die Kontrolle der Proliferation beeinflusst normale Prozesse wie Entwicklung und pathologische Prozesse wie Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Hyperplastisches Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen, zum Beispiel, wird angenommen, dass ein Vorläufer der Arteriosklerose3. Veränderungen in der Zellproliferation werden auch verwendet, um die potenzielle Toxizität neuer Medikamente zu bewerten. Angesichts ihrer weitverbreiteten Wirkung ist die Messung der Proliferation eine tragende Säule vieler Laboratorien auf Zellbiologiebasis.
Die Zellproliferation kann durch einfaches Zählen von Zellen gemessen werden, wenn sich die Zellpopulation von Interesse ziemlich schnell teilt. Bei langsamer wachsenden Zellen ist die Zellanzahl möglicherweise weniger empfindlich. Die Proliferation wird oft durch die Einbindung von markierten Nukleosid-Analogen gemessen. Obwohl der Goldstandard 3H-Thymidin-Einbau ist, kommen viele Laboratorien angesichts der Verfügbarkeit neuerer, nicht-radioaktiver Alternativen von dieser Methode weg. Dazu gehören zytoplasmatische Fluoreszenzfarbstoffe, der Nachweis von Zellzyklus-assoziierten Proteinen und die Einbeziehung nicht-radioaktiver Nukleosid-Analoge wie 5-Brom-2′-Deoxyuridin (BrdU) und 5-Ethynyl-2-Deoxyuridin (EdU)4.
Zytoplasmatische Farbstoffe, wie Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE), detektieren die Proliferation, da sich die Intensität des Farbstoffs jedes Mal halbiert, wenn sich die Zelle teilt5. Diese Technik wird häufig in der Durchflusszytometrie für nicht anhaftende Zellen verwendet. Es wurde nicht viel für anhängnisende Zellen verwendet, aber mit der neuen Generation von bildgebenden Plattenlesern kann sich dies ändern. Der Nachweis von Zellzyklus-assoziierten Proteinen durch Antikörper-basierte Techniken (Durchflusszytometrie, Immunhistochemie usw.) wird häufig für Gewebe oder nicht anhaftende Zellen verwendet. Diese Zellen/Gewebe müssen vor der Färbung fixiert und permeabilisiert werden. Nukleosid-Analoga BrdU und EdU ähneln sich in der Annäherung an 3H-Thymidin, jedoch ohne die Unannehmlichkeiten der Radioaktivität. Die Aufnahme von BrdU wird durch Anti-BrdU-Antikörper nachgewiesen, und daher müssen Zellen vor der Färbung fixiert und permeabilisiert werden. Darüber hinaus müssen Zellen mit DNase behandelt werden, um das BrdU-Epitop freizulegen.
Die Einbindung von EdU wird durch Klickchemie erkannt, bei der Alkyn- und Azidgruppen in Gegenwart von katalytischem Kupfer zusammen “klicken”. Beide Gruppen können als biosynthetisch eingebautes Molekül oder Detektionsmolekül4dienen. Kommerziell erhältliche Nukleosid-Analoga haben die Alkyngruppe angeschlossen. Bei Proliferationstests wird daher das alkyne-funktionalisierte Nukleosid-Analog durch ein Azid nachgewiesen, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem anderen Marker konjugiert ist. Die Eingemeindung von EdU hat mehrere Vorteile gegenüber BrdU. Erstens, da Alkyn- und Azidgruppen nicht in Säugetierzellen gefunden werden, ist diese Wechselwirkung sehr spezifisch mit einem niedrigen Hintergrund6. Da beide Gruppen klein sind, müssen sich Zellen keiner DNA-Denaturierung unterziehen, um das Nukleosid-Analog zu belichten, wie es für BrdU7erforderlich ist. Schließlich ist Click Chemistry sehr vielseitig und kann für die metabolische Kennzeichnung von DNA, RNA, Protein, Fettsäuren und Kohlenhydraten8,9,10,11verwendet werden. Befindet sich das metabolisch beschriftete Ziel auf der Zelloberfläche, können lebende Zellen als12bezeichnet werden. Darüber hinaus können Zellen für immunfluoreszierende Färbung mit Antikörpern weiterverarbeitet werden.
Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung von EdU-Inkorporation und Klickchemie, um die Proliferation in menschlichen vaskulären glatten Muskelzellen zu messen (Abbildung 1). Wir zeigen drei verschiedene Möglichkeiten auf, wie die Integration von EdU gemessen werden kann, repräsentative Ergebnisse aus jeder und ihre Vor- und Nachteile. Die Messung der Proliferation mittels Klickchemie ist besonders nützlich für anhantibe, langsamer wachsende Zellen. Darüber hinaus ist die Morphologie der Zelle gut gepflegt und auch antikörperbasierte Färbungen können durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Einbeziehung von EdU ist eine einfache, einfache Möglichkeit, die Zellproliferation zu messen; es ist besonders nützlich für anhängliche Zellen13. Unser Protokoll verwendet glatte Muskelzellen, aber es ist anwendbar auf jede anhängliche Zelle (epitheliale, endotheliale, etc.). Obwohl das Protokoll nicht kompliziert ist, ist der einzige entscheidende Schritt die Herstellung der Etikettierungslösung – die Zutaten müssen in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden. Darüber hinaus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Katie Carroll für die technische Unterstützung. Wir danken auch Dr. David Cool und dem Proteomics Analysis Laboratory für die Anleitung und Bereitstellung des Cytation Imaging Plate Readers. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Wright State Foundation (an L.E.W.) unterstützt.
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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