Измерение распространения сосудистых гладких мышечных клеток с помощью нажмите химии
Summary
Распространение является важной частью клеточной функции, и общие считывая используется для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Измерение пролиферации, таким образом, часто используется в клеточной биологии. Здесь мы представляем простой, универсальный метод измерения пролиферации, который может быть использован в клетках,приверженных и непридерживаться.
Abstract
Способность клетки размножаться является неотъемлемой частью нормальной функции большинства клеток, и дисрегуляция пролиферации лежит в основе многих процессов заболевания. По этим причинам измерение пролиферации является общим инструментом, используемым для оценки функции клеток. Пролиферация клеток может быть измерена просто путем подсчета; однако это косвенное средство измерения распространения. Одним из распространенных средств непосредственного обнаружения клеток, готовящихся к разделению, является включение помеченных нуклеозидных аналогов. К ним относятся радиоактивный нуклеозидный аналог 3H-тимидин плюс нерадиоактивные нуклеозидные аналоги, такие как 5-бромо-2′ deoxyuridine (BrdU) и 5-этинил-2 -deoxyuridine (EdU). Включение EdU обнаруживается по щелчку химии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с BrdU. В настоящем докладе мы предусматриваем протокол для измерения распространения путем включения Эду. Этот протокол включает в себя варианты различных считываний, а также преимущества и недостатки каждого из них. Мы также обсуждаем места, где протокол может быть оптимизирован или изменен для удовлетворения конкретных потребностей запланированного эксперимента. Наконец, мы касаемся способов, которыми этот базовый протокол может быть изменен для измерения других метаболитов клеток.
Introduction
Распространение является важнейшей частью клеточной функции1,2. Контроль распространения влияет на нормальные процессы, такие как развитие, и патологические процессы, такие как рак и сердечно-сосудистые заболевания. Гиперпластический рост сосудистых гладких мышечных клеток, например, считается предшественником атеросклероза3. Изменения в пролиферации клеток также используются для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Учитывая его широкое воздействие, измерение распространения является основой многих лабораторий, основанных на клеточной биологии.
Пролиферация клеток может быть измерена путем простого подсчета клеток, если популяция клеток, представляющих интерес, делится довольно быстро. Для более медленных растущих клеток количество клеток может быть менее чувствительным. Распространение часто измеряется путем включения помеченных нуклеозидных аналогов. Хотя золотой стандарт 3H-тимидин включения, многие лаборатории уходят от этого метода, учитывая наличие новых, нерадиоактивных альтернатив. К ним относятся цитоплазматические флуоресцентные красители, обнаружение связанных с клетками белков и включение нерадиоактивных нуклеозидных аналогов, таких как деоксюридин 5-бромо-2′ (BrdU) и 5-этинил-2 –deoxyuridine (EdU)4.
Цитоплазматические красители, такие как carboxyfluorescein диацетат succinimidyl эфир (CFSE), обнаружить пролиферацию, потому что интенсивность красителя половинки каждый раз, когда клетка делит5. Этот метод обычно используется в цитометрии потока для неприсоединения клеток. Он не был использован много для приверженцев клеток, но с новым поколением изображений пластины читателей это может измениться. Обнаружение клеточного цикла связанных белков с помощью антител на основе методов (поток цитометрии, иммуногистохимии и т.д.) часто используется для тканей или неприсоединения клеток. Эти клетки / ткани должны быть исправлены и проницательны до окрашивания. Нуклеозидные аналоги BrdU и EdU похожи по подходу к 3H-тимидину, но без неудобства радиоактивности. Включение BrdU обнаруживается анти-BrdU антител, и поэтому клетки должны быть фиксированными и проницаемыми до окрашивания. Кроме того, клетки должны рассматриваться dNase подвергать эпитоп BrdU.
Включение EdU обнаруживается щелчком химии, в которой алкин и азид групп “нажмите” вместе в присутствии каталитического меди. Любая группа может служить в качестве биосинтетически включены молекулы или обнаружения молекулы4. Коммерчески доступные нуклеозидные аналоги имеют алкин группы прилагается. Таким образом, для анализов пролиферации алкининовый нуклеозидный аналог обнаруживается ацидом азида, спряженный к флуоресцентному красищу или другому маркеру. Включение EdU имеет ряд преимуществ перед BrdU. Во-первых, потому что алкин и азид группы не встречаются в клетках млекопитающих, это взаимодействие является весьма конкретным с низким фоном6. Поскольку обе группы малы, клетки не должны проходить денатурацию ДНК, чтобы разоблачить аналог нуклеозидов, как это требуется для BrdU7. Наконец, нажмите химии является весьма универсальным, и может быть использован для метаболической маркировки ДНК, РНК, белка, жирных кислот и углеводов8,9,10,11. Если метаболически помеченная цель интереса находится на поверхности клетки, живые клетки могут быть помечены12. Кроме того, клетки могут быть дополнительно обработаны для иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.
Следующий протокол описывает использование edU включения и нажмите химии для измерения пролиферации в человеческих сосудистых гладких мышечных клеток(рисунок 1). Мы показываем три различных способа включения EdU могут быть измерены, репрезентативные результаты от каждого, и их преимущества и недостатки. Измерение пролиферации с помощью щелчка химии особенно полезно для приверженцев, медленнее растущих клеток. Кроме того, морфология клетки в хорошем состоянии и антитела на основе окрашивания также может быть выполнена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Включение EdU является простым, простым способом измерения пролиферации клеток; это особенно полезно для адептов клеток13. Наш протокол использует гладкие мышечные клетки, но он применим к любой клетке адепта (эпителиальная, эндотелиальная и т.д.). Хотя протокол не является с?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Кэти Кэрролл за техническую помощь. Мы также благодарим д-ра Дэвида Cool и Лаборатории анализа протеомики за обучение и предоставление считывателя пластин цитирования изображений Cytation. Эта работа была поддержана грантом Государственного фонда Райта (L.E.W.).
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. . Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
