Мы описываем метод использования многопараметрического потока цитометрии для обнаружения митохондриальных реактивных видов кислорода (ROS) в мурин здоровых гематопоиетических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) и лейкозных клеток из мышиной модели острого миелоидного лейкоза (AML) обусловлен MLL-AF9.
Мы представляем циклометрический подход потока для анализа митохондриального ROS в различных живых костных мозгах (БМ) полученных стволовых и прародителей клеток населения от здоровых мышей, а также мышей с AML обусловлен MLL-AF9. В частности, мы описываем двухступенчатый процесс окрашивания клеток, в котором здоровые или лейкозные клетки БМ сначала окрашиваются флюорогенным красителем, который обнаруживает митохондриальные супероксиды, а затем окрашивает с флюрохром-связанных моноклональных антител, которые используются различать различные здоровые и злокачественные популяции гематопоиетических прародителей. Мы также предоставляем стратегию для приобретения и анализа образцов с помощью цитометрии потока. Весь протокол может быть выполнен в срок, как короткие, как 3-4 ч. Мы также подчеркиваем ключевые переменные, которые следует учитывать, а также преимущества и ограничения мониторинга производства ROS в митохондриальном отсеке живой гематопоитической и лейкозной стеблей и субпопуляций гененора с использованием флюорогенных красителей при цитометрии потока . Кроме того, мы представляем данные о том, что митохондриальные ROS изобилие варьируется между различными здоровыми HSPC субпопуляций и лейкемии прародителей и обсудить возможные применения этой техники в гематологических исследований.
Реактивные виды кислорода (ROS) являются высокореактивными молекулами, полученными из молекулярного кислорода. Наиболее четко определенным клеточным расположением производства ROS являются митохондрии, где электроны, проходящие через цепочку транспортировки электронов (ETC) во время окислительного фосфорилирования (OXPHOS), поглощаются молекулярным кислородом, ведущим к образованию специфического тип ROS называетсясупероксиды 1. Благодаря действиям ряда ферментов, называемых супероксидными дисмутазами или СОД, супероксиды преобразуются в перекиси водорода, которые впоследствии нейтрализуются в воду такими ферментами, как каталаза или глутатион пероксидаза (GPX). Возмущения в механизмах РОСрегулирования могут привести к избыточному производству ROS, часто называемого окислительным стрессом, которые имеют вредные и потенциально смертельные клеточные последствия, такие как повреждение макромолекулы (т.е. ДНК, белок, липиды). Кроме того, окислительный стресс связан с несколькими патологиями, такими как диабет, воспалительные заболевания, старение и опухоли2,3,4. Для поддержания редокс гомеостаза и предотвращения окислительного стресса, клетки обладают различными механизмами, регулирующими СЕБЯ5.
Физиологические уровни некоторых ROS необходимы для правильного эмбрионального и взрослого гематопоезии6. Однако избыток ROS связан с повреждением ДНК, клеточной дифференциацией и истощением гематопоиетического стебля и бассейна-прародителя. Существует также доказательство того, что изменения в биологии Redox могут отличаться между лейкемией и здоровыми клетками. Например, уровни ROS, как правило, выше в острой миелоидной лейкемии (AML) клетки по сравнению с их здоровыми коллегами и другие исследования показали, что лейкемия стволовые клетки поддерживать низкий устойчивый уровень ROS для выживания7,8. Важно отметить, что стратегии терапевтической капитализации на этих различиях Redox показали обещание в нескольких условиях рака человека9,10. Таким образом, анализы, которые позволяют оценить уровни ROS в моделях мышей, могут улучшить наше понимание того, как эти виды способствуют клеточной физиологии и патогенеза заболеваний, а также потенциально обеспечивают платформу для оценки эффективности новые редокс-таргетинга противораковой терапии.
Флюорогенные красители, которые были разработаны для обнаружения ROS часто оцениваются в фиксированных клетках с помощью микроскопии или в живых клетках цитометрии потока22. Поток цитометрической оценки митохондриального ROS в клетках БМ с использованием митохондриальных ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Фокс Чейз онкологический центр совета директоров (DDM), Американское общество гематологии Стипендиат премии (SMS), Американское онкологическое общество RSG (SMS) и Министерство обороны (Награда: W81XWH-18-1-0472).
Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |