Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.
Abstract
Wir präsentieren einen flow cytometrischen Ansatz zur Analyse von mitochondrialem ROS in verschiedenen lebenden Knochenmark (BM)-abgeleiteten Stamm- und Vorläuferzellpopulationen von gesunden Mäusen sowie Mäusen mit AML, die von MLL-AF9 angetrieben werden. Insbesondere beschreiben wir einen zweistufigen Zellfärbeprozess, bei dem gesunde oder Leukämie-BM-Zellen zuerst mit einem fluorogenen Farbstoff gefärbt werden, der mitochondriale Superoxide erkennt, gefolgt von der Färbung mit fluorchromegebundenen monoklonalen Antikörpern, die verwendet werden. verschiedene gesunde und bösartige hämatopoetische Vorläuferpopulationen zu unterscheiden. Wir bieten auch eine Strategie für den Erwerb und die Analyse der Proben durch Durchflusszytometrie. Das gesamte Protokoll kann in einem Zeitrahmen von nur 3-4 h durchgeführt werden. Wir heben auch die wichtigsten zu berücksichtigenden Variablen sowie die Vorteile und Grenzen der Überwachung der ROS-Produktion im mitochondrialen Teil von lebenden hämatopoetischen und Leukämiestamm- und Vorläufersubpopulationen mit fluorogenen Farbstoffen durch Durchflusszytometrie hervor. . Darüber hinaus präsentieren wir Daten, dass die mitochondriale ROS-Fülle zwischen verschiedenen gesunden HSPC-Subpopulationen und Leukämie-Vorläufern variiert, und diskutieren die möglichen Anwendungen dieser Technik in der hämatologischen Forschung.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hochreaktive Moleküle, die aus molekularem Sauerstoff gewonnen werden. Der am besten definierte zelluläre Standort der ROS-Produktion ist die Mitochondrien, wo Elektronen, die während der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) durch die Elektronentransportkette (ETC) gehen, von molekularem Sauerstoff absorbiert werden, was zur Bildung einer spezifischen Art von ROS genannt Superoxide1. Durch die Aktionen einer Reihe von Enzymen, sogenannten Superoxid-Dismutasen oder SODs, werden Superoxide in Wasserstoffperoxide umgewandelt, die anschließend durch Enzyme wie Kataalase oder Glutathionperoxidasen (GPX) in Wasser neutralisiert werden. Störungen in ROS-Regulierungsmechanismen können zu einer übermäßigen Produktion von ROS führen, der oft als oxidativer Stress bezeichnet wird und schädliche und potenziell tödliche zelluläre Folgen wie Makromolekülschäden (z. B. DNA, Protein, Lipide) hat. Darüber hinaus ist oxidativer Stress mit mehreren Pathologien verbunden, wie Diabetes, entzündliche Erkrankungen, Alterung und Tumoren2,3,4. Um Die Homöostase von Redox aufrecht zu erhalten und oxidativen Stress zu verhindern, besitzen die Zellen eine Vielzahl von ROS-regulierenden Mechanismen5.
Physiologische Konzentrationen bestimmter ROS sind für eine ordnungsgemäße embryonale und erwachsene Hämatopoese6notwendig. Überschüssiges ROS ist jedoch mit DNA-Schäden, zellulärer Differenzierung und Erschöpfung des hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferpools verbunden. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Veränderungen in der Redoxbiologie zwischen Leukämie und gesunden Zellen unterscheiden können. Zum Beispiel, ROS-Spiegel neigen dazu, höher in akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellen im Vergleich zu ihren gesunden Gegenstücken und andere Studien haben vorgeschlagen, dass Leukämie-Stammzellen halten einen niedrigen stationären Zustand ROS für das Überleben7,8. Wichtig ist, Strategien zur therapeutischen Kapitalisierung dieser Redoxunterschiede haben in mehreren menschlichen Krebsumgebungen versprechend gezeigt9,10. Daher können Assays, die die Bewertung der ROS-Spiegel in Mausmodellen ermöglichen, unser Verständnis darüber verbessern, wie diese Arten zur zellulären Physiologie und Krankheitspathogenese beitragen, und potenziell eine Plattform für die Bewertung der Wirksamkeit von neuartige Nobox-targeting-Anti-Krebs-Therapien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fluorogene Farbstoffe, die für den Nachweis von ROS entwickelt wurden, werden häufig in festen Zellen durch Mikroskopie oder in lebenden Zellen durch Durchflusszytometrie22ausgewertet. Die zytometrische Fließbewertung von mitochondrialem ROS in BM-Zellen mit mitochondrialen ROS-Fluorenfarbstoffen hat zwei wesentliche Vorteile: 1) Es ist eine schnelle und einfache Technik, die für die Analyse von lebenden Zellen geeignet ist und 2) es ermöglicht, seltene Populationen auf einzelzeller Ebene im …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), dem American Society of Hematology Scholar Award (SMS), der American Cancer Society RSG (SMS) und dem Department of Defense (Auszeichnung: W81XWH-18-1-0472) unterstützt.
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
