הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9
Summary
אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.
Abstract
אנו מציגים את הגישה cytometric הזרימה עבור ניתוח מיטוכונדריאלי של רוס החיים שונים מח עצם (BM)-גזע נגזר ואוכלוסיות תאים מחולל שונות עכברים בריאים, כמו גם עכברים עם AML מונע על ידי MLL-AF9. באופן ספציפי, אנו מתארים תהליך מכתים של שני שלבים, לפיו תאים בריאים או לוקמיה מוכתמים הראשון עם צבע פלואורוגנטי המזהה על-ידי מיטוכונדריאלי, ואחריו כתמים עם נוגדנים monoochrome מקושרים המקושרים המשמשים כדי להבחין בין אוכלוסיות שונות בריאות וממאירות של המטפאות. כמו כן, אנו מספקים אסטרטגיה לרכישת וניתוח הדגימות על-ידי הזרמת cy, try. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע בתוך פרק זמן קצר כמו 3-4 h. אנו גם להדגיש את המשתנים מפתח לשקול, כמו גם את היתרונות ואת המגבלות של ניטור הייצור של ROS בתוך תא מיטוכונדריאלי של לחיות המטפאות לוקמיה גזע ומתת באמצעות צבעים fluorogenic על ידי הזרמת cy, . יתר על כן, אנו מציגים נתונים כי השפע מיטוכונדריאלי משתנה בין אוכלוסיות משנה בריאה HSPC בריא ו לוקמיה ושלתי ולדון ביישומים האפשריים של טכניקה זו במחקר המטקולוגי.
Introduction
מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי מאוד הנגזרות חמצן מולקולרי. המיקום הסלולארי המוגדר ביותר של הייצור של ROS הוא המיטוגיה, שם אלקטרונים העוברים דרך שרשרת התחבורה אלקטרון (וכו ‘) במהלך זירחון חמצוני (OXPHOS) נספגים על ידי חמצן מולקולרי המוביל היווצרות של מסוים סוג של רוס שנקרא סופרתחמוצות1. באמצעות הפעולות של סדרה של אנזימים, שנקרא סופראוקסיד dismutases או sods, סופראוקסיד מומרים לתוך מימן, אשר מנוטרלים לאחר מכן לתוך מים על ידי אנזימים כגון קטלאז או peroxidases גלוטתיון (gpx). רטבאליות במנגנונים ROS-רגולטוריות יכול להוביל לייצור עודף של ROS, המכונה לעתים קרובות לחץ חמצוני, אשר יש תוצאות מזיקות וקטלניות פוטנציאל הסלולר כגון נזק מקרומולקולה (כלומר, DNA, חלבון, שומנים). יתר על כן, לחץ חמצוני קשורה מספר פתווגיות, כגון סוכרת, מחלות דלקתיות, הזדקנות וגידולים2,3,4. כדי לשמור על הומאוסטזיס מחדש ולמנוע לחץ חמצוני, התאים בעלי מגוון של מנגנונים ROS-ויסות5.
רמות פיסיולוגיים של ROS מסוימים נחוצים עבור המטפיאה המתאימה ומבוגרים6. עם זאת, העודפים ROS קשורה עם נזק DNA, בידול הסלולר ותשישות של גזע המטפאות ובריכת מחולל קדמון. יש גם ראיות כי שינויים בביולוגיה החמצון עשוי להיות שונה בין לוקמיה ותאים בריאים. לדוגמה, רמות ROS נוטים להיות גבוהים יותר בלוקמיה של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ביחס לעמיתיהם הבריאים שלהם ומחקרים אחרים הציעו כי תאי גזע לוקמיה לשמור על רמה נמוכה יציבה המדינה של רוס להישרדות7,8. חשוב מכך, אסטרטגיות לקבלת הבדלי מחלות מבחינה רפואית בהבדלים הללו הראו הבטחה במספר הגדרות סרטןהאדם 9,10. לכן, בחני אומר כי לאפשר הערכה של רמות ROS בדגמי העכבר עשוי לשפר את ההבנה שלנו איך מינים אלה תורמים לפיזיולוגיה הסלולר מחלות פתוגנזה, כמו גם פוטנציאל לספק פלטפורמה להערכת האפקטיביות של הרומן נגד חמצון-מיקוד טיפולים נגד סרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
צבעים fluorogenic כי פותחו לאיתור של ROS מוערכים לעתים קרובות בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופ או בתאים חיים על ידי הזרימה cy, try22. הערכת הערכה לזרימה של רוס מיטוכונדריאלי בתאי BM באמצעות צבעי fluorogenic מיטוכונדריאלי יש שני יתרונות עיקריים: 1) זוהי טכניקה מהירה ופשוטה המתאימה לניתוח תאים חיים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי הדירקטוריון פוקס מרדף מרכז מנהלים (DDM), האגודה האמריקנית להמטולוגיה פרס המלומד (SMS), האגודה האמריקנית לסרטן RSG (SMS) ומשרד ההגנה (הפרס: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
