Multipl skleroz tedavisi olmayan inflamatuar demyelleştirilme bir hastalıktır. Beyin dokusunun analizi, hastalığın patogenezini anlamak için önemli ipuçları sağlar. Burada Cleveland Clinic operasyonunda benzersiz bir hızlı otopsi programı ile toplanan MS beyin dokusu metodolojisi ve aşağı analiz tartışmak.
Biz multipl skleroz ile bireyler için hızlı bir doku bağış programı açıklamak (MS) bilim adamları ve teknisyenler On-Call 24/7 olmak gerektirir, 365 gün bir yıl. Katılımcılar beyin ve omuriliği bağışlamayı onaylıyor. Çoğu hastada Bayan tedavi ve araştırma için Cleveland Clinic Mellen merkezi ‘nde nörolog izledi. Klinik kursları ve nörolojik özürlü iyi karakterize edilmiştir. Ölümden kısa bir süre sonra, vücut, beynin situ içinde 3 T manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile taranabileceği MS Imaging Center ‘a taşınır. Vücut sonra otopsi odasına aktarılır, beyin ve omurilik kaldırılır nerede. Beyin iki yarımküreler ayrılmıştır. Bir yarımküre hemen Dilimleme kutusuna yerleştirilir ve alternatif 1 cm kalınlığında dilimler ya iki gün için% 4 civarında formaldehite sabit veya hızla kuru buz ve 2-metilbutan dondurulmuş. Kısa sabit Beyin dilimleri, bir ağoprezervasyon çözümünde saklanır ve hassas antijenlerin histolojik analizleri ve immünositozokimyasal olarak algılanması için kullanılır. Frozen dilimleri-80 °C ‘ de saklanır ve moleküler, immünosittokimyasal ve in situ hybridization/RNA kapsam çalışmalarında kullanılır. Diğer Yarımküre birkaç ay boyunca% 4 civarında formaldehite yerleştirilir, Dilimleme kutusuna yerleştirilen, 3 T manyetik rezonans (Mr) tarayıcı yeniden taranan ve santimetrelik kalın dilimleri içine dilimlenmiş. Postmortem In situ MR görüntüleri (MRIs) MRI-patoloji korelasyonlar kolaylaştırmak için 1 cm-kalın Beyin dilimleri ile ortak kayıtlı. Tüm Beyin dilimleri fotoğraflanmış ve beyin beyaz madde lezyonları tanımlanır. Omurilik 2 cm segmentlerinde kesilir. Alternatif segmentler% 4 civarında formaldehite veya hızla donmuş olarak sabitlenir. Postmortem MS dokularının hızlı tedariki, MS beyin ve spinal tellerin patolojik ve moleküler analizlerini ve beyin MRG anomalilerinin patolojik korelasyonlarını sağlar. Bu hızla işlenmiş postmortem dokularının kalitesi (genellikle 6 ölüm h içinde) MS araştırma için büyük değer ve birçok yüksek etkili keşifler sonuçlandı.
Bir hastalığı incelemek için en iyi yollarından biri hastalıklı doku kendisini incelemek için. Bu, merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları çalışma olanlar için zorluklar sunar. Hastalıklı beyin ve Omurilik biyopsisi son derece nadirdir ve genellikle atipik vakalar içerir. CNS hastalıkları olan bireyler için otopsi oranları son yıllarda dramatik bir şekilde azaldı, ve yapıldığında, genellikle dokuların hızlı tedarik sağlamaz. Bu zorluklar, multipl skleroz (MS) olan bireylerden doku toplama üzerine odaklanan birkaç dahil olmak üzere hastalık merkezli beyin bankalarının kurulması ile sonuçlandı. MS, miyelin, oligodendrosit (miyelin şekillendirme hücreleri), nöronlar ve akonlar yok eden CNS bir inflamatuar-aracılı hastalıktır. MS hastalarının çoğunluğu, sonunda doğal olarak nörodejeneratif olan bir kademeli-Progressive hastalığa dönüşen değişken iyileşme ile nörolojik özürlülük nöbetleri ile başlayan bir iki-fazik hastalık kursuna sahiptir1. Bağışlanan MS beyinleri çoğunluğu için, ölüm ve doku işleme arasında postmortem aralıkları (PMı) 24 h aşıyor. Bu dokularda MS beynin patolojik değişiklikleriyle ilgili değerli bilgiler sağlanırken, hastalık patofizyolojisine güçlü Öngörüler sağlayan daha gelişmiş moleküler çalışmalar için uygun değildir. Bu özellikle gen profilleme çalışmaları için durum, hangi sağlam RNA gerektirir.
Yukarıda tartışılan sınırlamaları aşmak için, MRG/patolojik korelasyonlar sağlayan hızlı bir doku bağış programı geliştirdik. Bu protokol modern Moleküler çalışmalar için uygun iyi korunmuş dokular sağlar ve MS beynin beyin patolojisinin ve MRG anomalilerinin doğrudan karşılaştırılması sağlar. Cleveland Clinic multipl skleroz doku bağış programı 20 yılı aşkın süredir varlığını ele aldı. Bu hızlı doku bağış programı, MS ve diğer ilişkili otoimmün nörolojik koşullar ile bireylerden beyin ve spinal kabloları sağlar. Program, ölüm 6 h içinde situ MRI elde etmeyi amaçlamaktadır, doku işleme için beyin ve omurilik kaldırılması takip.
Işe alım
Bağışlar, doğrudan hastalarımdan (önceden kabul edilen) veya ölümden sonra akrabalarından elde edilen ante-mortem onayı yoluyla elde edilir. Önceden onaylı hastalar genellikle Cleveland, Ohio multipl skleroz tedavi ve araştırma Mellen merkezi ‘nde klinik nüfus tanımlanır. Uzunlamasına araştırma çalışmalarında takip edilen hastalara hızlı doku bağış programında işe alma tercihi verilse de, merkezde görülen tüm hastalara açıktır. Ölüm öncesinde kayıt katılımcılar aile üyeleri veya bakım sağlayıcıları için araştırma ekibi, ya ölüm sırasında ya da ölüm yakın olduğu düşünülmektedir zaman iletişim için talimatlar verilir. Bireylerin doku bağış programına girmek için ikinci yöntem akrabası tarafından onay yoluyla ölüm zamanında. Ohio Devlet ölümlerin bir federasyona görevlendirilir gerektirir organ alımı organizasyon LifeBanc adlı, hangi faaliyet 20 Kuzeydoğu Ohio ilçeleri. LifeBanc, organ bağış için bir dışlama olan MS tanısı için tüm ölümler ekranlar. Düzenlemeleri LifeBanc MS doku bağış programı Bayan bir ilişkili tanı ile tüm ölümler için dedektifler bildirmek için yapılan bir 75-mil yarıçapı Cleveland Clinic içinde ortaya çıkan. Sonraki akrabaları ve hastane personeli daha sonra doku bağış programı personeli ile temas ve onay beyin ve omurilik dokularının bağış için elde edilir. İstihdam Ante bu iki yöntem-mortem ve post-mortem LifeBanc yoluyla yılda yaklaşık 10-12 beyin bağış sonucu. Ayarları lifebanc gelen tavsiyeleri sayısını yönetmek için ölüm üst yaş sınırına yapılır.
Bağış temini
Program, doku temini için doku Bağış programının üyeleri tarafından yılda 365 gün 24 saat kapsama alanı gerektirir. Merkezi bir doku bağış bildirim e-postası/çağrı cihazı/mobil cihaz metin bildirim sistemi doku bağışları kapsayan klinik takım tarafından kullanılır. LifeBanc, doku bağış programı için çağrı yapan personele başvuracak sayılar sağlamaktadır. Üyeleri hastane sağlayıcıları tarafından ölüm bildirilir/akrabası (ön-RIZALI) veya LifeBanc ve diğer yönlendirme kaynakları tarafından. İlk olarak, ölüm zamanı ve doku bağış fizibilite belirlenmesi yapılır. Ölümler daha sonra potansiyel olarak düşük kaliteli doku neden koşullar için ekran, uzun süreli ön mortem hipoksi dahil, büyük yıkıcı beyin dokusu (örn., büyük intrakranial kanama, geniş bi-hemherik vuruş, geniş tümör Yük), uzun süreli ventilatör desteği (> 3 gün) ve ölümden önce vazoaktif ajanların (> 3 gün) uzun süreli kullanımı. Bir tıbbi tetkikçi bir ölüme dahil olduğunda, çalışma nörolog tıbbi tetkikçi sorumluluğunu ödün vermeden zamanında dokulara almak için bir yol keşfetmek için tıbbi muayene ile konuşabilir. Eğer uygun doku mevcut hissedilecektir, o zaman yazılı onay elde edilir (önceden mortem elde değilse) ve preparatlar vücut taşıma için yapılır. Daha önce sözleşmeli bir entedent ulaşım hizmeti daha sonra Cleveland Clinic MRI tesislerinden ulaşım için temasa geçti. Vücudun oda sıcaklığında kalması ve soğutmaya yerleştirilmemiş olması, düşük vücut sıcaklıklarının MRG sinyal özellikteki değişikliklerle ilişkilendirildiğinden emin olmak için bakım alınır.
Klinik Tarih
Klinik Tarih, MS tanısı, semptomların başlangıcı, kullanılan tedaviler, klinik ve para-Klinik testlerin sonuçları (uyarılmış potansiyeller, beyin omurilik sıvıları sonuçları, optik kostence tomografi), multipl skleroz fonksiyonel kompozit ve genişletilmiş özürlülük durum ölçeği (EDSS; gerçek veya tahmini), hangi tıbbi kayıt (mevcut) toplanan ve akrabası sonraki doğrudan röportaj. Önceden mortem MRI da toplanır.
Biz hızlı bir şekilde elde etmek için kullanılan bir protokol açıklamak ve MS ile 150 ‘ den fazla bireylerin doku süreci. Bu protokolün önemli bir özelliği, doku kullanan bilim adamlarının da protokol kurulması ve doku koleksiyonunu gerçekleştirmekte sorumlu olmasıdır. Bu, bireysel araştırma projelerinin bilimsel ihtiyaçlarını karşılamak için esneklik sağlar. Bu protokolün çeşitli yönleri, yardımcı programını geliştirir. Hastalar genellikle ölümden önce iyi karakterize edilir, birçoğu bizim merkezimizde nörolog tarafından takip edilmiştir. Kritik bir adım, diğer bazı beyin bankalarına kıyasla dondurulmuş dokusunun kalitesini artıran, ölümden hemen sonra doku bağışlarının işlenmesi. Bu, histolojik ve immünosittokimyasal gözlemlerin ispatı için gerekli olan transkripsiyon ve translasyonel gen ürünlerinde yapılan değişikliklerin tanımlanması konusunda büyük değer veren Moleküler çalışmalar sağlar. Birden fazla olguda morfolojik/immünositokimyasal ve moleküler verilerden yararlanarak sonuçların güvenilirliğini arttırır. Bu en iyi serebral korteks mitokondriyal gen değişiklikleri ve demiyeli hipokampi nöronal gen değişiklikleri bizim açıklama tarafından gösterilmiştir. Yeni gen profil protokolleri hızlı bir hızda geliştirilmiştir ve bankanızın dondurulmuş dokusu, doku ve tek hücreli analizler için yüksek kaliteli RNA sağlamalıdır.
Protokolün bir başka değerli yönü kısa sabit Beyin dilimleri. Bu dokular 30 μm kalınlığında, serbest yüzen bölümler halinde kesilir. Bu bölümler üç boyutta iki veya daha fazla antijenleri analiz etmek için Konfokal mikroskobik kullanmak için idealdir. İyi örnekler, kronik MS lezyonlarında distrofik akons ile ön myelinating oligodendtrosit süreçlerinin etkileşimi, hem de kesildi akgen retraksiyon ampuller tek akal bağlantıların tanımlanması. Bu, 3D görüntülerin uygulanabilir olmadığı 7 μm kalınlığında parafin bölümlerinin rutin kullanımına tersine kullanılır. Parafin-gömülü dokularda bazı sorular için büyük değer vardır, özellikle hemherik 7 μm-kalın bölümlerde nöronal yoğunluklarının ölçülmesini. Bu nedenle doku işleme protokollerimiz çeşitlidir ve sabit ve hızlı dondurulmuş dokulara garanti vermek için esneklik sağlar.
Protokolün bir başka benzersiz özelliği postmortem içinde situ beyin MRG olduğunu. Brain MRIs MS hastalığının bir yer değiştirebilen biyomarker vardır. Bu nedenle, anormal MRG sinyallerinin patolojik ilişkilendirlerini kurmak esastır. Çalışmalarımız, T2 sadece ve T2T1MTR ROIs ‘in genellikle myelinated olduğunu tespit etmiştir. Bu bulgu, miyelinli ve demyelinli serebral beyaz maddeyi güvenilir bir şekilde ayırt eden daha spesifik görüntüleme modalitelerinin ihtiyacını desteklemektedir. MRI, miyelin algılanması için hassas görünüyor, ancak çalışmalarımız, T1/T2/MTR kombinasyonunun bile myelasyon tespiti için özel olmadığını gösteriyor. Postmortem protokollerimiz, yeni görüntüleme modalitelerinin miyelinli ve demyelinli serebral beyaz maddeyi ayırt etme yeteneğini test etmek için ideal bir platform sunar. MRI, translasyonel araştırmalarımızda MRI kullanımı ve yaşayan hastalarda yaygın klinik kullanımı göz önüne alındığında, temel bilim sonuçlarının klinik uygulamaya çevirisi için ideal bir araç sağlar.
Kısa ve uzun sabit yanı sıra dondurulmuş dilimleri kesme sırasında farklı çalışmalar için birden fazla modda doku işleme için bir avantaj sunuyor, bu yöntem ile bazı sınırlamalar vardır. Bir yapının tamamını değerlendirmek, bölümler bitişik dilimler üzerinde farklı şekilde işlenebilir gibi sınırlı olabilir. Doku bankasının büyük hacmi, ancak, örnekleme geliştirmek için birden fazla konuda ilgi bir yapısını araştırmak için yeteneği sunuyor. Postmortem dokular kullanan çalışmalar için başka bir genel sınırlama onlar çapraz-kesit olmasıdır. Değişikliklerin zamanlamaya ve ilerlemesine ilişkin sonuçlar bu bağlamda yorumlanması gerekir. Onların dokularını bağışlayan hastalar için bir seçim önyargı olabilir, hangi MS ile tüm hastalara veri genelleştirme sınırlandırabilir. Çoğu bağış Gelişmiş MS komplikasyonlarından ölmek beri, bu hasta MS önceki aşamalarında bu hastalarda bulgularını elde etmek için uygun olmayabilir. Yine de, MS ile ilgili olmayan durumlardan (Yani akut miyokard infarktüsü, ilaç aşırı doz, intihar) ölen genç hastalarda dokuları aldık. Protokolün kapsamı, MS ‘de bulunan diğer organların (örneğin gastrointestinal ve kemik iliği) örneklemesini içermez. Biz programın güçlü büyük ölçüde sınırlamaları ağır tartmak inanıyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar da Dr Christopher Nelson editoryal yardım için teşekkür etmek istiyorum. Otopsi programı kısmen R35 hibe NS097303 BDT tarafından desteklenmektedir. RD laboratuarında çalışma, NINDS (NS096148) ve ulusal multipl skleroz Derneği, ABD (RG 5298) ‘ den hibe tarafından desteklenmektedir.
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |