Multiple sclerose is een inflammatoire demyelinerende ziekte zonder genezing. Analyse van hersenweefsel biedt belangrijke aanwijzingen om de pathogenese van de ziekte te begrijpen. Hier bespreken we de methodologie en downstreamanalyse van MS hersenweefsel verzameld via een uniek snel autopsie programma in werking in de Cleveland Clinic.
We beschrijven een Rapid tissue donatieprogramma voor individuen met multiple sclerose (MS) dat vereist dat wetenschappers en technici op afroep 24/7, 365 dagen per jaar zijn. Deelnemers geven toestemming om hun hersenen en ruggenmerg te doneren. De meeste patiënten werden gevolgd door neurologen in het Cleveland Clinic Mellen Center voor MS behandeling en onderzoek. Hun klinische cursussen en neurologische handicaps zijn goed gekarakteriseerd. Kort na de dood wordt het lichaam getransporteerd naar het MS Imaging Center, waar de hersenen in situ worden gescand door 3 T magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Het lichaam wordt vervolgens overgebracht naar de autopsie kamer, waar de hersenen en het ruggenmerg worden verwijderd. De hersenen zijn verdeeld in twee hersenhelften. Een halve bol wordt onmiddellijk in een snijden box geplaatst en alternatieve 1 cm dikke plakjes worden ofwel in 4% Paraformaldehyde vastgesteld voor twee dagen of snel bevroren in droogijs en 2-methylbutaan. De korte-vaste hersen segmenten worden opgeslagen in een cryopreservatie-oplossing en gebruikt voor histologische analyses en immunocytochemische detectie van gevoelige antigenen. Bevroren plakjes worden opgeslagen bij-80 °C en gebruikt voor moleculaire, immunocytochemische en in situ hybridisatie/RNA Scope studies. Het andere halfrond wordt gedurende enkele maanden in 4% Paraformaldehyde geplaatst, in de snijden box geplaatst, opnieuw gescand in de 3 T magnetische resonantie (Mr) scanner en gesneden in centimeter dikke plakjes. Postmortem in situ Dhr images (Mri’s) zijn samen geregistreerd met 1 cm dikke hersen schijfjes om de correlaties van MRI-pathologie te vergemakkelijken. Alle hersen schijfjes worden gefotografeerd en hersenletsels worden geïdentificeerd. Het ruggenmerg wordt in 2 cm segmenten gesneden. Alternatieve segmenten worden vastgesteld in 4% Paraformaldehyde of snel bevroren. De snelle aanschaf van postmortem MS-weefsels maakt pathologische en moleculaire analyses mogelijk van MS-hersenen en ruggengraat koorden en pathologische correlaties van MRI-afwijkingen in de hersenen. De kwaliteit van deze snel verwerkte postmortemweefsels (meestal binnen 6 h van de dood) is van grote waarde voor MS-onderzoek en heeft geresulteerd in veel high-impact ontdekkingen.
Een van de beste manieren om een ziekte te bestuderen is om het zieke weefsel zelf te onderzoeken. Dit presenteert uitdagingen voor diegenen die ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS) bestuderen. Biopsies van zieke hersenen en ruggenmerg zijn zeer zeldzaam en meestal betrekking hebben op atypische gevallen. Autopsie tarieven voor individuen met CNS ziekten zijn drastisch gedaald in de afgelopen jaren, en wanneer uitgevoerd, ze bieden vaak geen snelle aanschaf van weefsels. Deze uitdagingen hebben geresulteerd in de oprichting van ziekte gerichte hersen banken, waaronder verschillende gericht op het verzamelen van weefsels van individuen met multiple sclerose (MS). MS is een ontstekings-gemedieerde ziekte van het CZS die myeline, oligodendrocyten (myeline vormende cellen), neuronen en axonen vernietigt. De meerderheid van de MS-patiënten heeft een bi-fasische ziekte cursus die begint met aanvallen van neurologische handicaps met variabel herstel dat zich uiteindelijk ontwikkelt tot een geleidelijk progressieve ziekte die waarschijnlijk neurodegeneratief is in de natuur1. Voor de meerderheid van de gedoneerde MS-hersenen zijn de postmortemintervallen (PMI) tussen de dood en weefsel verwerking meer dan 24 uur. Hoewel deze weefsels waardevolle informatie hebben verschaft over pathologische veranderingen in MS-hersenen, zijn ze niet geschikt voor geavanceerdere moleculaire studies die krachtige inzichten kunnen geven in pathofysiologie van de ziekte. Dit is met name het geval voor genprofilerings studies, die intact RNA vereisen.
Om de hierboven besproken beperkingen te overwinnen, hebben we een Rapid tissue donatieprogramma ontwikkeld dat MRI/pathologische correlaties mogelijk maakt. Dit protocol biedt goed bewaarde weefsels die geschikt zijn voor moderne moleculaire studies en maakt directe vergelijking van hersen pathologie en MRI-afwijkingen in MS-hersenen mogelijk. Het Cleveland Clinic programma voor weefseldonatie met multiple sclerose bestaat al meer dan 20 jaar. Dit snelle weefseldonatie programma koopt hersenen en ruggengraat koorden van individuen met MS en andere geassocieerde auto-immune neurologische aandoeningen. Het programma is bedoeld om in situ MRIs binnen 6 h van de dood te verkrijgen, gevolgd door verwijdering van de hersenen en het ruggenmerg voor weefsel verwerking.
Werving
Donaties worden verkregen door middel van een ante-mortemtoestemming die rechtstreeks is verkregen van patiënten (vooraf ingestemd) of van de naaste van de kin na de dood. Vooraf toegestemd patiënten worden meestal geïdentificeerd uit de klinische populatie in het Mellen Center voor multiple sclerose behandeling en onderzoek in Cleveland, Ohio. Hoewel de voorkeur in rekrutering in het Rapid tissue donatieprogramma wordt gegeven aan patiënten die in longitudinale onderzoeken zijn gevolgd, is het open voor alle patiënten die in het centrum worden gezien. Deelnemers die zich vóór de dood inschrijven, krijgen instructies voor familieleden of zorgverleners om contact op te nemen met het onderzoeksteam, hetzij op het moment van overlijden of wanneer de dood dreigt te worden verwacht. De tweede methode voor individuen om het weefseldonatie programma in te voeren is op het moment van overlijden door toestemming door de naaste van kin. De staat Ohio eist dat sterfgevallen worden doorverwezen naar een federaal-gemandateerde orgaan Procurement organisatie LifeBanc, die in 20 provincies in het noordoosten van Ohio opereert. LifeBanc screent alle sterfgevallen voor een diagnose van MS, wat een uitsluiting is voor orgaandonatie. LifeBanc heeft een regeling getroffen om onderzoekers van het MS tissue donatieprogramma op de hoogte te stellen van alle sterfgevallen met een geassocieerde diagnose van MS die zich voordoen binnen een straal van 75 mijl van de Cleveland Clinic. Naast kin en ziekenhuispersoneel worden vervolgens gecontacteerd door het weefseldonatie programma personeel en toestemming wordt verkregen voor donatie van hersenen en ruggenmerg weefsels. Deze twee methoden voor de aanwerving van een ante-en een post-mortem via LifeBanc resulteren in ongeveer 10-12 hersen donaties per jaar. Aanpassingen worden aangebracht in de leeftijdsgrens van de dood voor het beheren van het aantal verwijzingen die zijn afgeleid van LifeBanc.
Aanschaf van donaties
Het programma vereist 24 h dekking, 365 dagen per jaar door leden van het weefseldonatie programma voor weefsel inkoop. Een gecentraliseerde kennisgeving van weefseldonatie e-mail/pager/mobiel apparaat tekst meldingssysteem wordt gebruikt door het klinische team dat weefsel donaties. LifeBanc is voorzien van nummers om contact op te nemen met personeel voor het weefseldonatie programma. Leden worden op de hoogte gesteld van overlijden door ziekenhuis aanbieders/Next of kin (vooraf ingestemd) of door LifeBanc en andere verwijzingsbronnen. Ten eerste wordt een bepaling van de tijd van overlijden en haalbaarheid van weefseldonatie gemaakt. Sterfgevallen worden vervolgens gescreend op aandoeningen die mogelijk resulteren in weefsel van slechte kwaliteit, met inbegrip van langdurige pre-mortem hypoxie, enorm destructief hersenweefsel (bijv. grote intracraniële bloeding, uitgebreide bi-hemiferische beroertes, extensieve tumor Last), verlengde ventilator ondersteuning (> 3 dagen) en langdurig gebruik van vasoactieve agentia (> 3 dagen) vóór de dood. Wanneer een medische examinator betrokken is bij een overlijden, kan de studie-neuroloog met de medische onderzoeker spreken om een manier te onderzoeken om tijdige weefsels te ontvangen zonder afbreuk te doen aan de verantwoordelijkheid van de medische examinator. Als er levensvatbare weefsels aanwezig zijn, wordt schriftelijke toestemming verkregen (indien niet voor het slachten verkregen) en worden preparaten gemaakt voor het vervoer van het lichaam. Een eerder gecontracteerde decedent-transportdienst wordt vervolgens gecontacteerd voor transport naar de MRI-faciliteiten in de Cleveland Clinic. Zorg wordt besteed om ervoor te zorgen dat het lichaam op kamertemperatuur blijft en niet in de koeling wordt geplaatst, omdat lagere lichaams temperaturen gepaard gaan met veranderingen in de kenmerken van het MRI-signaal.
Klinische geschiedenis
Klinische geschiedenis bevat informatie over de diagnose van MS, aanvang van de symptomen, gebruikte behandelingen, resultaten van klinische en para-klinische testen (evoked potentials, cerebrospinale vloeistof resultaten, optische coherentie tomografie), multiple sclerose functionele composiet en uitgebreide invaliditeits status schaal (EDSS; feitelijk of geschat), die worden verzameld uit het medische dossier (indien beschikbaar) en direct interview van Next of kin. Ook wordt een pre-mortem MRI verzameld.
We beschrijven een protocol dat is gebruikt voor het snel aanschaffen en verwerken van weefsel van meer dan 150 individuen met MS. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is dat de wetenschappers die het weefsel gebruiken ook belast zijn met het tot stand brengen van het protocol en het uitvoeren van de weefsel verzameling. Dit biedt flexibiliteit bij het voldoen aan de wetenschappelijke behoeften van individuele onderzoeksprojecten. Verschillende aspecten van dit protocol verbeteren het nut ervan. De patiënten zijn meestal goed gekarakteriseerd vóór de dood, omdat velen van hen zijn gevolgd door neurologen in ons centrum. Een kritieke stap is de verwerking van weefsel donaties kort na de dood, wat de kwaliteit van het bevroren weefsel verhoogt in vergelijking met sommige andere hersen banken. Dit maakt moleculaire studies mogelijk die van grote waarde zijn bij het beschrijven van veranderingen in transcriptionele en translationele genproducten, die essentieel zijn voor de onderbouwing van histologische en immunocytochemische waarnemingen. Het gebruik van morfologische/immunocytochemische en moleculaire gegevens in meerdere gevallen verhoogt de betrouwbaarheid van de conclusies. Dit is het beste geïllustreerd door onze beschrijving van mitochondriale gen veranderingen in cerebrale cortex en neuronale gen veranderingen in demyelgefluoreerde hippocampi. Nieuwe genprofilerings protocollen worden snel ontwikkeld en het bevroren weefsel in onze bank moet kwalitatief hoogwaardig RNA bieden voor weefsel-en eencellige analyse.
Een ander waardevol aspect van ons protocol zijn de korte-vaste hersen sneden. Deze weefsels worden in 30 μm dikke, vrij zwevende delen gesneden. Deze secties zijn ideaal voor het gebruik van confocale microscopie om twee of meer antigenen in drie dimensies te analyseren. Goede voorbeelden zijn de interactie van pre-myelinerende oligodendrocyten processen met dystrofische axonen in chronische MS laesies, evenals de identificatie van enkelvoudige axonale verbindingen naar sneden axonale terugtrek lampen. Dit is in tegenstelling tot het routinematige gebruik van paraffine profielen met een dikte van 7 μm, waarbij 3D-beelden niet haalbaar zijn. Paraffine-ingesloten weefsels hebben een grote waarde voor sommige vragen, met name de kwantificering van neuronale dichtheden in hemiferische 7 μm-dikke delen. Onze weefsel verwerkingsprotocollen zijn daarom divers en bieden flexibiliteit om vaste en snel bevroren weefsels te verzekeren.
Een ander uniek kenmerk van ons protocol is de postmortem in situ hersen MRI. Hersen Mri’s zijn een onvervangbaar biomarker van MS-ziekte. Het is daarom essentieel om de pathologische correlaten van abnormale MRI-signalen vast te stellen. Uit onze studies is gebleken dat zowel T2 als T2T1MTR ROIs vaak myelfluorzijn. Deze bevinding ondersteunt de behoefte aan specifiekere beeldvormings modaliteiten die betrouwbaar onderscheid maken tussen myelinehoudende en gedemyelineerde cerebrale witte materie. MRI lijkt gevoelig te zijn voor de detectie van myeline, maar onze studies tonen aan dat zelfs een combinatie van T1/T2/MTR niet specifiek is voor het identificeren van myelinisatie. Ons postmortemprotocol biedt een ideaal platform om het vermogen van nieuwe beeldvormings modaliteiten te testen om onderscheid te maken tussen myelinehoudende en gedemyelineerde cerebrale witte materie. MRI biedt ook het ideale voertuig voor de vertaling van elementaire wetenschappelijke resultaten in de klinische praktijk, gezien het gebruik van MRI in ons translationeel onderzoek en het wijdverbreide klinische gebruik bij levende patiënten.
Terwijl het snijden van korte-en lang-vaste en bevroren segmenten een voordeel biedt voor het verwerken van weefsel in meerdere modi voor verschillende studies, zijn er enkele beperkingen met deze methode. De beoordeling van het geheel van een structuur kan worden beperkt, aangezien gedeelten ervan verschillend kunnen worden verwerkt op aangrenzende segmenten. Het grote volume van de weefselbank biedt echter de mogelijkheid om een structuur van belangstelling voor meerdere proefpersonen te onderzoeken om de bemonstering te verbeteren. Een andere algemene beperking van onderzoeken met behulp van postmortemweefsels is dat ze cross-sectional zijn. De conclusies met betrekking tot de timing en de voortgang van de veranderingen moeten in deze context worden geïnterpreteerd. Er kan een selectie bias zijn voor patiënten die hun weefsels doneren, wat de generalisatie van gegevens kan beperken tot alle patiënten met MS. Aangezien de meeste donoren sterven aan complicaties van gevorderde MS, is het wellicht niet gepast om de bevindingen van deze patiënten te extrapoleren naar die in eerdere stadia van MS. Desalniettemin hebben we weefsels ontvangen van jongere patiënten die zijn gestorven aan niet-MS-gerelateerde aandoeningen (d.w.z. acuut myocardinfarct, overdosis drugs, zelfmoord). Het toepassingsgebied van ons protocol omvat geen bemonstering van andere organen (bijv. gastro-intestinale en beenmerg) die bij MS betrokken zijn geweest. Wij geloven dat de sterke punten van het programma sterk opwegen tegen de beperkingen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen ook Dr. Christopher Nelson bedanken voor de redactionele hulp. Het autopsie programma wordt deels ondersteund door R35 Grant NS097303 aan BDT. Het werk in het laboratorium van RD wordt ondersteund door beurzen van NINDS (NS096148) en de National Multiple Sclerose Society, VS (RG 5298).
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |