Multiple Sklerose ist eine entzündliche demyelinisierende Krankheit ohne Heilung. Die Analyse von Hirngewebe liefert wichtige Hinweise auf das Verständnis der Pathogenese der Krankheit. Hier diskutieren wir die Methodik und die nachgelagerte Analyse von MS-Gehirngewebe, das durch ein einzigartiges Schnellautopsieprogramm in der Cleveland Clinic gesammelt wurde.
Wir beschreiben ein schnelles Gewebespendeprogramm für Personen mit Multipler Sklerose (MS), bei dem Wissenschaftler und Techniker 24/7, 365 Tage im Jahr, auf Abruf sind. Die Teilnehmer stimmen zu, ihr Gehirn und Rückenmark zu spenden. Die meisten Patienten wurden von Neurologen am Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research verfolgt. Ihre klinischen Kurse und neurologischen Behinderungen sind gut charakterisiert. Kurz nach dem Tod wird der Körper zum MS Imaging Center transportiert, wo das Gehirn vor Ort durch 3 T Magnetresonanztomographie (MRT) gescannt wird. Der Körper wird dann in den Autopsieraum gebracht, wo Gehirn und Rückenmark entfernt werden. Das Gehirn ist in zwei Hemisphären unterteilt. Eine Hemisphäre wird sofort in eine Schneidebox gelegt und abwechselnd 1 cm dicke Scheiben werden entweder zwei Tage lang in 4% Paraformaldehyd fixiert oder schnell in Trockeneis und 2-Methylbutan eingefroren. Die kurzfixierten Hirnscheiben werden in einer Kryokonservierungslösung gespeichert und für histologische Analysen und den immunzytochemischen Nachweis empfindlicher Antigene verwendet. Gefrorene Scheiben werden bei -80 °C gelagert und für molekulare, immunzytochemische und In-situ-Hybridisierungs-/RNA-Scope-Studien verwendet. Die andere Hemisphäre wird mehrere Monate lang in 4% Paraformaldehyd gelegt, in die Schneidebox gelegt, im 3 T Magnetresonanzscanner (MR) erneut gescannt und in zentimeterdicke Scheiben geschnitten. Postmortem in situ MR-Bilder (MRT) werden mit 1 cm dicken Hirnscheiben koregistriert, um MRT-Pathologie-Korrelationen zu erleichtern. Alle Hirnscheiben werden fotografiert und Hirn-Weißmaterie-Läsionen identifiziert. Das Rückenmark wird in 2 cm Segmente geschnitten. Alternative Segmente werden in 4% Paraformaldehyd fixiert oder schnell eingefroren. Die schnelle Beschaffung von postmortalen MS-Geweben ermöglicht pathologische und molekulare Analysen von MS-Gehirnen und Rückenmarks sowie pathologische Korrelationen von MRT-Anomalien des Gehirns. Die Qualität dieser schnell verarbeiteten postmortalen Gewebe (in der Regel innerhalb von 6 h nach dem Tod) ist von großem Wert für die MS-Forschung und hat zu vielen hochwirksamen Entdeckungen geführt.
Eine der besten Möglichkeiten, eine Krankheit zu untersuchen, ist, das erkrankte Gewebe selbst zu untersuchen. Dies stellt diejenigen vor Herausforderungen, die Krankheiten des Zentralnervensystems (ZNS) untersuchen. Biopsien von krankem Gehirn und Rückenmark sind extrem selten und beinhalten in der Regel atypische Fälle. Autopsieraten bei Personen mit ZNS-Erkrankungen sind in den letzten Jahren dramatisch zurückgegangen, und wenn sie durchgeführt werden, bieten sie oft keine schnelle Beschaffung von Geweben. Diese Herausforderungen haben zur Einrichtung von krankheitszentrierten Gehirnbanken geführt, darunter mehrere, die sich auf das Sammeln von Geweben von Personen mit Multipler Sklerose (MS) konzentrierten. MS ist eine entzündlich-vermittelte Erkrankung des ZNS, die Myelin, Oligodendrozyten (Myelin bildende Zellen), Neuronen und Axone zerstört. Die Mehrheit der MS-Patienten haben einen bi-phasischen Krankheitsverlauf, der mit anfallen neurologischen Behinderungen mit variabler Genesung beginnt, die sich schließlich zu einer allmählich fortschreitenden Erkrankung entwickelt, die in der Natur wahrscheinlich neurodegenerativ ist1. Bei der Mehrheit der gespendeten MS-Gehirne übersteigen die postmortalen Intervalle (PMI) zwischen Tod und Gewebeverarbeitung 24 h. Während diese Gewebe wertvolle Informationen über pathologische Veränderungen im MS-Gehirn geliefert haben, sind sie nicht für fortgeschrittenere molekulare Studien geeignet, die leistungsstarke Einblicke in die Krankheitpathophysiologie liefern können. Dies gilt insbesondere für Genprofilierungsstudien, die intakte RNA erfordern.
Um die oben beschriebenen Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein schnelles Gewebespendeprogramm entwickelt, das MRT/pathologische Korrelationen ermöglicht. Dieses Protokoll bietet gut erhaltene Gewebe, die für moderne molekulare Studien geeignet sind, und ermöglicht einen direkten Vergleich von Hirnpathologie und MRT-Anomalien im MS-Gehirn. Das Cleveland Clinic Multiple Sklerose Gewebe-Spendenprogramm besteht seit über 20 Jahren. Dieses schnelle Gewebespende-Programm beschafft Gehirne und Rückenmark von Personen mit MS und anderen damit verbundenen autoimmunen neurologischen Erkrankungen. Das Programm zielt darauf ab, In-situ-MRTs innerhalb von 6 h nach dem Tod zu erhalten, gefolgt von der Entfernung von Gehirn und Rückenmark für die Gewebeverarbeitung.
rekrutierung
Spenden werden entweder durch die ante-mortem-Zustimmung erhalten, die direkt von Patienten (vorzustimmunged) oder von nächsten Verwandten nach dem Tod eingeholt wird. Voreinvernehmliche Patienten werden in der Regel aus der klinischen Bevölkerung am Mellen Center for Multiple Sklerose Treatment and Research in Cleveland, Ohio, identifiziert. Obwohl Patienten, die in Längsstudien verfolgt wurden, bevorzugt bei der Rekrutierung im Schnellgewebespendeprogramm bevorzugt werden, steht sie allen Patienten offen, die im Zentrum gesehen werden. Teilnehmer, die sich vor dem Tod einschreiben, erhalten Anweisungen für Familienmitglieder oder Pflegedienstleister, sich mit dem Forschungsteam in Verbindung zu setzen, entweder zum Zeitpunkt des Todes oder wenn der Tod als unmittelbar bevorstehend angesehen wird. Die zweite Methode für Einzelpersonen, das Gewebespendeprogramm zu betreten, ist zum Zeitpunkt des Todes durch Zustimmung der nächsten Verwandten. Der Us-Bundesstaat Ohio verlangt, dass Todesfälle an eine vom Bund beauftragte Organbeschaffungsorganisation namens LifeBanc verwiesen werden, die in 20 Countys im Nordosten Ohios tätig ist. LifeBanc prüft alle Todesfälle auf eine Ms-Diagnose, was ein Ausschluss für Organspenden ist. LifeBanc wurde vorkehrungen getroffen, die Ermittler des MS-Gewebespendeprogramms für alle Todesfälle mit einer damit verbundenen Diagnose von MS zu benachrichtigen, die in einem Umkreis von 75 Meilen von der Cleveland Clinic auftreten. Die nächsten Mitarbeiter des Verwandten und Deskrankenhauses werden dann vom Personal des Gewebespendeprogramms kontaktiert und die Zustimmung zur Spende von Hirn- und Rückenmarksgewebe eingeholt. Diese beiden Methoden der Rekrutierung ante-mortem und post-mortem durch LifeBanc führen zu etwa 10-12 Gehirnspenden pro Jahr. Es werden Anpassungen an der oberen Altersgrenze des Todes vorgenommen, um die Anzahl der von LifeBanc abgeleiteten Empfehlungen zu verwalten.
Beschaffung von Spenden
Das Programm erfordert 24 h Abdeckung, 365 Tage im Jahr von Mitgliedern des Gewebespende-Programms für die Gewebebeschaffung. Das klinische Team, das Gewebespenden abdeckt, verwendet ein zentrales Textbenachrichtigungssystem für Gewebespenden. LifeBanc erhält Nummern, um das Bereitschaftspersonal für das Gewebespendeprogramm zu kontaktieren. Mitglieder werden von Krankenhausanbietern/nächsten Angehörigen (vorzustimmunged) oder von LifeBanc und anderen Überweisungsquellen über den Tod informiert. Erstens wird der Zeitpunkt des Todes und die Durchführbarkeit der Gewebespende bestimmt. Todesfälle werden dann auf Bedingungen untersucht, die möglicherweise zu minderwertigem Gewebe führen, einschließlich längerer vor-mortem Hypoxie, massivem destruktivem Hirngewebe (z. B. große intrakranielle Blutungen, ausgedehnte bihemisphärische Schlaganfälle, umfangreiche Tumor Dauerventilatorunterstützung (>3 Tage) und längere Anwendung von vasoaktiven Wirkstoffen (>3 Tage) vor dem Tod. Wenn ein medizinischer Prüfer an einem Tod beteiligt ist, kann der Studienneurologe mit dem medizinischen Prüfer sprechen, um einen Weg zu erkunden, wie rechtzeitig Gewebe empfangen werden, ohne die Verantwortung des medizinischen Prüfers zu beeinträchtigen. Wenn sich als lebensfähiges Gewebe bemerkbar gemacht wird, wird eine schriftliche Zustimmung eingeholt (wenn nicht vor dem Mortem erlangt) und Es werden Vorbereitungen für den Körpertransport getroffen. Ein zuvor vertraglich vereinbarter Transportdienst wird dann für den Transport zu den MRT-Einrichtungen der Cleveland Clinic kontaktiert. Es wird darauf geachtet, dass der Körper bei Raumtemperatur bleibt und nicht in die Kühlung gebracht wird, da niedrigere Körpertemperaturen mit Veränderungen der MRT-Signaleigenschaften verbunden sind.
Klinische Geschichte
Die klinische Geschichte umfasst Details zur Diagnose von MS, zum Auftreten der Symptome, zu behandlungen, zu Ergebnissen klinischer und paraklinischer Tests (evozierte Potenziale, Cerebrospinalflüssigkeitsergebnisse, optische Kohärenztomographie), Multiple-Sklerose-Funktionsverbund , und erweiterte Behinderung Statusskala (EDSS; tatsächliche oder geschätzte), die aus der Krankenakte gesammelt werden (sofern verfügbar), und direkte Befragung der nächsten Verwandten. Vor-mortem MRT werden ebenfalls gesammelt.
Wir beschreiben ein Protokoll, das verwendet wurde, um schnell Gewebe von über 150 Personen mit MS zu beschaffen und zu verarbeiten. Ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls ist, dass die Wissenschaftler, die das Gewebe nutzen, auch für die Erstellung des Protokolls und die Durchführung der Gewebesammlung verantwortlich sind. Dies bietet Flexibilität bei der Erfüllung der wissenschaftlichen Bedürfnisse einzelner Forschungsprojekte. Mehrere Aspekte dieses Protokolls verbessern seinen Nutzen. Die Patienten sind in der Regel vor dem Tod gut charakterisiert, da viele von ihnen von Neurologen in unserem Zentrum gefolgt wurden. Ein kritischer Schritt ist die Verarbeitung von Gewebespenden kurz nach dem Tod, was die Qualität des gefrorenen Gewebes im Vergleich zu einigen anderen Gehirnbanken erhöht. Dies ermöglicht molekulare Studien, die bei der Beschreibung von Veränderungen in transkriptionellen und translationalen Genprodukten von großem Wert sind, die für die Substantiation histologischer und immunzytochemischer Beobachtungen unerlässlich sind. Die Nutzung morphologischer/immunozytochemischer und molekularer Daten in mehreren Fällen erhöht die Zuverlässigkeit von Schlussfolgerungen. Dies zeigt sich am besten in unserer Beschreibung von mitochondrialen Genveränderungen in der Großhirnrinde und neuronalen Genveränderungen in demyelinierten Hippocampi. Neuartige Genprofilierungsprotokolle werden schnell entwickelt und das gefrorene Gewebe in unserer Bank sollte hochwertige RNA für Gewebe- und Einzelzellanalysen liefern.
Ein weiterer wertvoller Aspekt unseres Protokolls sind die kurzfixierten Gehirnscheiben. Diese Gewebe werden in 30 m dicke, frei schwebende Abschnitte geschnitten. Diese Abschnitte sind ideal für die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um zwei oder mehr Antigene in drei Dimensionen zu analysieren. Gute Beispiele sind die Wechselwirkung von vormyelinierenden Oligodendrozytenprozessen mit dystrophischen Axonen bei chronischen MS-Läsionen sowie die Identifizierung einzelner axonaler Verbindungen zu transektierten axonalen Retraktionsbirnen. Dies steht im Gegensatz zur routinemäßigen Verwendung von 7 m dicken Paraffinabschnitten, bei denen 3D-Bilder nicht möglich sind. Paraffin-eingebettete Gewebe haben einen großen Wert für einige Fragen, insbesondere die Quantifizierung der neuronalen Dichten in hemisphärischen 7-m-dicken Abschnitten. Unsere Gewebeverarbeitungsprotokolle sind daher vielfältig und bieten Flexibilität, um festes und schnell eingefrorenes Gewebe zu gewährleisten.
Ein weiteres einzigartiges Merkmal unseres Protokolls ist die postmortale In-situ-Gehirn-MRT. Hirn-MRTs sind ein unersetzlicher Biomarker der MS-Krankheit. Es ist daher wichtig, die pathologischen Korrelationen von abnormen MRT-Signalen zu ermitteln. Unsere Studien haben ergeben, dass sowohl T2- als auch T2T1MTR-ROIs oft myeliniert sind. Dieser Befund unterstützt die Notwendigkeit spezifischerer bildgebender Verfahren, die zuverlässig zwischen myelinierter und demyelinierter zerebraler weißer Materie unterscheiden. MRT scheint empfindlich für den Nachweis von Myelin zu sein, aber unsere Studien zeigen, dass selbst eine Kombination von T1/T2/MTR nicht spezifisch für die Identifizierung der Myelination ist. Unser Postmortem-Protokoll bietet eine ideale Plattform, um die Fähigkeit neuer bildgebender Verfahren zu testen, um zwischen myelinierter und demyelinierter zerebraler weißer Materie zu unterscheiden. DIE MRT ist auch das ideale Instrument für die Umsetzung grundlegender wissenschaftlicher Ergebnisse in die klinische Praxis, da SIE MRT in unserer translationalen Forschung einsetzen und sie bei lebenden Patienten weit verbreitet sind.
Während das Schneiden von kurz- und langfesten sowie gefrorenen Scheiben einen Vorteil für die Verarbeitung von Gewebe in verschiedenen Modi für verschiedene Studien bietet, gibt es einige Einschränkungen mit dieser Methode. Die Bewertung der Gesamtheit einer Struktur kann eingeschränkt sein, da Teile davon auf benachbarten Slices unterschiedlich verarbeitet werden können. Das große Volumen der Gewebebank bietet jedoch die Möglichkeit, eine Struktur von Interesse in mehreren Probanden zu untersuchen, um die Probenahme zu verbessern. Eine weitere allgemeine Einschränkung für Studien, die postmortale Gewebe verwenden, ist, dass sie Querschnittsmittel sind. Schlussfolgerungen zum Zeitpunkt und zum Fortschreiten der Veränderungen müssen in diesem Zusammenhang interpretiert werden. Es kann eine Selektionsverzerrung für Patienten geben, die ihr Gewebe spenden, was die Verallgemeinerung der Daten auf alle Patienten mit MS beschränken kann. Da die meisten Spender an Komplikationen fortgeschrittener MS sterben, ist es möglicherweise nicht angemessen, die Befunde dieser Patienten auf die Inden früherer MS-Stadien zu extrapolieren. Nichtsdestotrotz haben wir Gewebe von jüngeren Patienten erhalten, die an nicht-MS-bedingten Erkrankungen starben (d. h. akuter Myokardinfarkt, Drogenüberdosierung, Selbstmord). Der Anwendungsbereich unseres Protokolls umfasst nicht die Probenahme anderer Organe (z. B. Magen-Darm- und Knochenmark), die an MS beteiligt waren. Wir glauben, dass die Stärken des Programms seine Grenzen bei weitem überwiegen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken auch Dr. Christopher Nelson für die redaktionelle Unterstützung. Das Autopsieprogramm wird teilweise durch R35 Grant NS097303 an BDT unterstützt. Die Arbeit im Labor für RD wird durch Stipendien von NINDS (NS096148) und der National Multiple Sklerose Society, USA (RG 5298) unterstützt.
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |