多发性硬化症是一种炎症性脱骨髓疾病,没有治愈的方法。脑组织分析为了解疾病的发病机制提供了重要线索。在这里,我们讨论在克利夫兰诊所运行中通过独特的快速解剖程序收集的MS脑组织的方法和下游分析。
我们描述了一个针对多发性硬化症(MS)患者的快速组织捐赠计划,该计划要求科学家和技术人员每年365天24小时待命。参与者同意捐献他们的大脑和脊髓。克利夫兰梅伦MS治疗和研究中心的神经学家随后对大多数患者进行了跟踪。他们的临床课程和神经残疾是良好的特征。死亡后不久,尸体被运送到MS成像中心,在那里通过3T磁共振成像(MRI)对大脑进行原位扫描。尸体随后被转移到验尸室,在那里大脑和脊髓被切除。大脑被分成两个半球。一个半球立即放在一个切片盒中,交替的1厘米厚的切片要么固定在4%的甲醛中两天,要么迅速冻结在干冰和2-甲基丁烷中。短固定脑切片储存在冷冻保存溶液中,用于组织学分析和敏感抗原的免疫细胞化学检测。冷冻切片储存在-80°C,用于分子、免疫细胞化学和原位杂交/RNA范围研究。另一半球被置于4%的甲醛中几个月,放在切片盒中,在3T磁共振(MR)扫描仪中重新扫描,并切成厘米厚的切片。原位MR图像(MRI)与1厘米厚的脑切片共同注册,以促进MRI-病理学相关性。所有脑切片都得到拍摄,大脑白质病变被识别。脊髓被切成2厘米的段。备用段固定在4%的甲醛或快速冻结。死后MS组织的快速采购允许MS大脑和脊髓的病理和分子分析以及脑MRI异常的病理相关性。这些快速处理的验尸组织的质量(通常在死亡6小时内)对MS研究具有极大的价值,并导致了许多高影响力的发现。
研究疾病的最好方法之一是检查病变组织本身。这给研究中枢神经系统疾病(CNS)的人带来了挑战。患病的大脑和脊髓的活检极为罕见,通常涉及非典型病例。近年来,患有中枢神经系统疾病的个人的验尸率已大幅下降,在进行时,他们往往不能快速采购组织。这些挑战导致建立了以疾病为中心的脑库,包括几个侧重于从多发性硬化症(MS)患者那里收集组织。MS 是一种炎症介导的中枢神经系统疾病,破坏骨髓素、寡核苷酸(骨髓形成细胞)、神经元和斧子。大多数MS患者有双相病过程,开始与神经残疾与可变恢复,最终演变为一种渐进的疾病,可能是神经退行性的性质1。对于大多数捐赠的MS大脑,死亡和组织处理之间的验尸间隔(PMI)超过24小时。虽然这些组织提供了关于MS大脑病理变化的宝贵信息,但它们并不适合更高级的分子研究,这些研究可以为疾病病理生理学提供强有力的见解。基因分析研究尤其如此,需要完整的RNA。
为了克服上述限制,我们开发了一个快速组织捐赠计划,允许MRI/病理相关性。该协议提供了适合现代分子研究的保存良好的组织,并允许直接比较MS大脑中的大脑病理学和MRI异常。克利夫兰诊所多发性硬化组织捐赠计划已经存在了20多年。这个快速的组织捐赠计划从患有MS和其他相关自身免疫性神经系统疾病的个人获得大脑和脊髓。该计划旨在在死亡6小时内获得原位核磁共振成像,然后切除大脑和脊髓进行组织处理。
招聘
捐赠是通过直接从患者(事先同意)或死后从近亲获得的预验尸同意获得的。在俄亥俄州克利夫兰的梅伦多发性硬化治疗和研究中心,通常从临床人群中确定预先同意的患者。虽然在快速组织捐赠计划招募中优先考虑在纵向研究方面一直遵循的患者,但它对所有在中心看到的患者开放。死亡前登记的参与者被指示家庭成员或护理提供者在死亡时或死亡迫在眉睫时与研究小组联系。个人进入组织捐赠计划的第二种方法是在死亡时经近亲同意。俄亥俄州要求将死亡报告提交联邦授权的器官采购组织LifeBanc,该组织在俄亥俄州东北部的20个县开展业务。LifeBanc 对所有死亡进行筛选,以诊断 MS,这是器官捐赠的排除。LifeBanc 已做出安排,通知 MS 组织捐赠计划的调查人员所有死亡,并在克利夫兰诊所方圆 75 英里范围内进行 MS 相关诊断。然后,组织捐赠计划工作人员与近亲和医院工作人员联系,并征得捐赠大脑和脊髓组织的同意。这两种通过LifeBanc进行预验尸和验尸的方法每年导致大约10-12次脑捐献。调整死亡年龄上限,以管理从LifeBanc获得的转诊数量。
采购捐款
该计划要求24小时覆盖,每年365天由组织捐赠计划的成员组织采购。覆盖组织捐赠的临床团队使用集中组织捐赠通知电子邮件/寻呼机/移动设备文本通知系统。LifeBanc 提供电话,以便与组织捐赠计划的随叫随到人员联系。医院提供者/近亲(事先同意)或 LifeBanc 和其他转诊来源将会员告知死亡。首先,确定死亡时间和组织捐赠的可行性。然后对死亡进行筛查,以确定可能导致组织质量差的情况,包括长期的验尸前缺氧、大量破坏性脑组织(例如,颅内大出血、广泛的双半球中风、广泛的肿瘤负担),延长呼吸机支持(>3天),以及长时间使用血管活性剂(>3天)死亡前。当一名法医介入死亡时,研究神经学家可以与医学检验员交谈,探索一种在不损害验尸官责任的情况下及时接收组织的方法。如果认为有活的组织存在,则获得书面同意(如果未获得验尸前),并为身体运输做好准备。然后联系先前签约的死者运输服务,以便运送到克利夫兰诊所的 MRI 设施。注意确保身体保持在室温下,并且不会放入冷藏中,因为较低的体温与 MRI 信号特性的变化相关。
临床病史
临床病史包括MS诊断、症状发作、所用治疗、临床和准临床检测结果(诱发电位、脑脊液结果、光学一致性断层扫描)、多发性硬化症功能复合,和扩大残疾状况表(EDSS;实际或估计),从病历(如有)收集,并直接与近亲面谈。还会收集验尸前 MRI。
我们描述了一种协议,该协议已用于从 150 多名 MS 患者中快速采购和处理组织。该协议的一个重要特点是,利用该组织的科学家也负责建立协议和执行组织收集。这为满足个别研究项目的科学需要提供了灵活性。该协议的几个方面增强了它的效用。患者通常在死前特征良好,因为许多患者都跟随了我们中心的神经学家。关键的一步是在死亡后不久处理组织捐赠,这与其他一些脑库相比,提高了冷冻组织的质量。这使得分子研究在描述转录和转化基因产物的变化方面具有重大价值,这对于组织学和免疫细胞化学观察的证实至关重要。利用多种情况下的形态/免疫细胞化学和分子数据可提高结论的可靠性。我们描述脑皮层的线粒体基因变化和去骨髓化海马的神经元基因变化,最能说明这一点。新型基因分析方案正在快速开发中,我们库的冷冻组织应该为组织和单细胞分析提供高质量的RNA。
我们协议的另一个重要方面是短固定脑切片。这些组织被切成30微米厚的自由浮动部分。这些部分非常适合使用共聚焦显微镜在三维分析两个或多个抗原。很好的例子包括骨髓前寡核苷酸过程与慢性MS病变中的营养不良性斧子的相互作用,以及识别与横端的斧状缩回球的单个斧状连接。这与7μm厚的石蜡截面的常规使用形成鲜明对比,在3D图像不可行的情况下。石蜡嵌入组织对一些问题有很大的价值,特别是半球7微米厚的部分神经元密度的定量。因此,我们的组织处理方案多种多样,可提供灵活性,确保固定和快速冷冻的组织。
我们协议的另一个独特特征是原位脑MRI的验尸。脑磁共振成像是MS疾病不可替代的生物标志物。因此,建立异常MRI信号的病理相关性至关重要。我们的研究表明,仅T2和T2T1MTR ROIs经常被骨髓化。这一发现支持需要更具体的成像模式,可靠地区分骨髓和脱骨髓性脑白质。MRI似乎对骨髓的检测很敏感,但我们的研究表明,即使T1/T2/MTR的组合也不专门用于识别骨髓。我们的验尸协议为测试新的成像模式区分骨髓和脱骨髓性脑白质的能力提供了一个理想的平台。MRI 还提供了将基础科学成果转化为临床实践的理想工具,因为 MRI 在我们的转化研究中使用,并在活患者中广泛使用。
虽然切割短片、长固定切片以及冷冻切片为不同研究的多种模式处理组织提供了优势,但这种方法存在一些局限性。评估整个结构可能会受到限制,因为结构的某些部分可能在相邻切片上以不同的方式处理。然而,组织库的体积大,提供了研究多个受试者感兴趣的结构的能力,以改进采样。利用死后组织的研究的另一个一般限制是它们是横截面的。需要在此背景下解释关于变更的时间和进展的结论。捐赠其组织的患者可能存在选择偏差,这可能限制所有 MS 患者的数据通用化。由于大多数捐赠者死于晚期MS并发症,因此将这些患者的发现推断为MS早期患者可能并不合适。尽管如此,我们还是收到了因非MS相关疾病(即急性心肌梗死、药物过量、自杀)而死亡的年轻患者的纸巾。我们的协议范围不包括与MS有关的其他器官(如胃肠道和骨髓)的取样。我们相信,该计划的优势远远大于其局限性。
The authors have nothing to disclose.
作者还要感谢克里斯托弗·纳尔逊博士的编辑协助。验尸程序部分由R35授予BDTNS097303支持。研发实验室的工作得到NINDS(NS096148)和美国国家多发性硬化协会(RG 5298)的资助。
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |