Summary

Un modelo murino avanzado para esteatohepatitis no alcohólica en asociación con diabetes tipo 2

Published: April 26, 2019
doi:

Summary

Se describe un modelo animal simple y confiable para la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta, que se logra a través de la carcasa no SPF de los animales y la administración de una dieta alta en grasas específica. Describimos la identificación de los subconjuntos de células inmunes hepáticas y adiposas para recapitular las condiciones inmunológicas humanas exponiendo ratones a gérmenes ambientales.

Abstract

La obesidad se asocia con la inflamación crónica de bajo grado y la resistencia a la insulina, contribuyendo a una creciente prevalencia de enfermedades metabólicas crónicas, como la diabetes tipo 2 y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). Investigaciones recientes han establecido que las células inmunes pro-inflamatorias infiltran tejido adiposo hipertrófico obeso y el hígado. Dada la importancia emergente de las células inmunitarias en el contexto de la homeostasis metabólica, hay una necesidad crítica de cuantificar y caracterizar su modificación durante el desarrollo de la diabetes tipo 2 y NASH. Sin embargo, los modelos animales que inducen características fisiopatológicas típicas del NASH humano son escasos.

En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para identificar subconjuntos de células inmunitarias aisladas del hígado y el tejido adiposo en un modelo de ratón confiable de NASH, establecido por la vivienda de ratones con dieta alta en grasas (HFD) bajo condiciones no específicas de patógenos (SPF) sin un barrera durante al menos siete semanas. Demostramos el manejo de ratones en condiciones no SPF, digestión de los tejidos y la identificación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), células dendríticas, B y células T subconjuntos por citometría de flujo. Se proporcionan diagramas de citometría de flujo representativos de ratones con SPF HFD y ratones que no son SPF. Para obtener datos fiables e interpretables, el uso de anticuerpos, métodos precisos y precisos para la digestión de los tejidos y la correcta compuerta en los experimentos de citometría de flujo son elementos críticos.

La intervención para restaurar la exposición fisiológica del antígeno en ratones alojándolos en condiciones no SPF y la exposición no específica a antígenos microbianos podría proporcionar una herramienta relevante para investigar el vínculo entre las alteraciones inmunológicas, inducida por la dieta obesidad y complicaciones relacionadas a largo plazo.

Introduction

La obesidad es un trastorno multifactorial y un factor de riesgo importante para desarrollar enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes tipo 2 (T2D) y algunos tipos de cáncer. La prevalencia de la obesidad está aumentando rápidamente en todo el mundo. Hoy en día, 2,1 mil millones personas — casi el 30% de la población mundial — son obesas o con sobrepeso1. La resistencia a la insulina asociada a la obesidad puede conducir a T2D, cuando las células beta del islote pancreático agotado no logran compensar la mayor necesidad de insulina para mantener la la homeostasis de la glucosa2.

El tejido adiposo se compone de varios tipos de células, incluyendo adipocitos, células endoteliales, fibroblastos y células inmunitarias. Durante la progresión de la obesidad, los cambios en el número y la actividad de las células inmunitarias pueden provocar una inflamación de bajo grado del tejido adiposo hipertrófico3,4. Específicamente, se ha encontrado que la ingesta excesiva de energía, acompañada de niveles crónicamente elevados de glucosa en sangre, triglicéridos y ácidos grasos libres, conduce a la hipoxia adipocíta, estrés retículo endoplásmico, deterioro de la función mitocondrial y mejora de la secreción de citoquinas, lo que resulta en la activación de las células inmunitarias proinflamatorias de la adiposa5,6. Investigaciones pasadas se han centrado principalmente en la inmunidad innata, pero más recientemente las células inmunes adaptables (células T y B) han surgido como reguladores importantes de la homeostasis de la glucosa. Poseen inflamatorios (incluyendo células t CD8+ , Th1, y células B) o principalmente funciones regulatorias (incluyendo células reguladoras t (treg), células Th2) y pueden exacerbar o proteger contra la resistencia a la insulina7,8 , 9.

Además, se propusieron varios mecanismos para explicar cómo la obesidad aumenta la esteatohepatitis, incluyendo el aumento de la producción de citoquinas por tejido adiposo10. NASH, la forma progresiva de hígado graso no alcohólico y una importante carga sanitaria en los países desarrollados, se caracteriza histológicamente por los hepatocitos en globo, la acumulación de lípidos, la fibrosis y la inflamación pericelular y puede progresar hasta cirrosis, enfermedad hepática terminal o carcinoma hepatocelular. Varios régimen (por ejemplo, la dieta deficiente de metionina y colina11) se sabe que inducen la patología hepática como Nash en modelos animales no humanos, pero la mayoría de estos enfoques no recapitulan las condiciones humanas de Nash y su metabolismo consecuencias, ya sea que requieran un nocaut genético específico, manipulaciones dietéticas no fisiológicas o la falta de resistencia a la insulina típica de NASH humano. Por otra parte, nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas se basa actualmente en experimentos llevados a cabo con ratones de laboratorio alojados bajo condiciones estándar específicas libres de patógenos (SPF). Esas instalaciones de barrera son anormalmente higiénicas y no consideran la diversidad microbiana que los seres humanos tienen que encontrar, lo que puede tener en cuenta las dificultades en el proceso de traducción de los estudios en animales a los enfoques clínicos12,13 , 14.

Para investigar los diferentes subconjuntos de células inmunes en el tejido adiposo y el hígado durante el desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH en un modelo avanzado de ratón que reproduce las condiciones inmunológicas humanas, los ratones se alojaron en jaulas individuales en semi estéril condiciones sin barreras. Los ratones alojados bajo condiciones expuestas al antígeno desarrollaron patología hepática como la de NASH ya después de 15 semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD)13. En comparación con los ratones SPF adaptados a la edad, desarrollaron esteatosis macrovesicular, infiltración hepática y activación de células inmunitarias.

Este manuscrito describe un análisis robusto de citometría de flujo para definir y contar subconjuntos de células inmunitarias del tejido adiposo del ratón y del hígado en un modelo de NASH. El análisis de citometría de flujo permite la detección de múltiples parámetros de células individuales simultáneamente en contraste con los enfoques RT-PCR o inmunohistoquímica.

En Resumen, nuestro estudio ofrece un modelo de ratón de HFD a corto plazo para la investigación del desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH y los mecanismos subyacentes que también exhibe la fidelidad a la condición humana.

Protocol

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y la ley de bienestar animal bajo la supervisión de nuestro Comité institucional de cuidado y uso de animales. Los protocolos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas institucionales de la Charité Berlin, Alemania, y fueron aprobados por el Landesamt für Gesundheit und Soziales y cumplen con las pautas de llegada. 1. modelo a…

Representative Results

El protocolo descrito permite la caracterización de marcadores superficiales de células inmunitarias innatas y adaptativas aisladas del tejido adiposo de la murina perigonadal y del hígado en un modelo de NASH inducido por la dieta. En este modelo, NASH fue inducido por la administración de HFD más sacarosa (6%) en el agua potable durante 7 a 15 semanas en ratones C57Bl/6J, como se informó anteriormente13. Es importante destacar que los ratones estaban alojados en condiciones semi estériles…

Discussion

La esteatohepatitis tiene una fuerte asociación con anomalías metabólicas como la obesidad, la resistencia a la insulina y la dislipidemia15. Varios estudios indican que la inflamación del tejido adiposo puede conducir la patogénesis de la diabetes tipo 2, incluidos los niveles alterados de células del sistema inmunitario innato y adaptativo4,5,16,17 . Además, se …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Anke Jurisch, Diana Woellner, Dra. Kathrin Witte y Cornelia Heckmann la asistencia con procedimientos experimentales y Benjamin Tiburzy de Biolegend para comentarios útiles sobre la estrategia de la puerta. J.S. fue apoyado por la beca Helmholtz (ICEMED). Este estudio fue apoyado por becas de la unidad de investigación clínica del Instituto de salud de Berlín (BIH), el “BCRT-Grant” por el Ministerio Federal alemán de educación e investigación y la Fundación Einstein. K.S.-B. y H.-D.V. son financiados por FOR2165.

Materials

100µm cell strainers  Falcon 352340
1ml syringe  BD   309659
26G x 5/8 needles  BD  305115
35mm Petri Dishes  Falcon 353001
40µm cell strainers  Falcon 352340
ACK lysis buffer  GIBCO A1049201
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Biolegend  103127 AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)
Analysis software  FlowJo 10.0.8 software
APC anti-mouse CD11c Antibody Biolegend  117309 AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)
APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody Biolegend  138411 AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)
BV421 anti-mouse CD127 Antibody Biolegend  135023 AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)
BV421 anti-mouse F4/80 Antibody Biolegend  123131 AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)
BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody Biolegend  135219 AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)
BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody Biolegend  108739 AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)
BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody Biolegend  101239 AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)
BV711 anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend  103255 AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)
BV785 anti-mouse CD8a Antibody Biolegend  100749 AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)
C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old  Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2  Charité – Universitätsmedizin Berlin A119.1 
Collagenase NB 4G Proved Grade  SERVA  11427513
Collagenase Typ I  Worthington  LS004197
Conical centrifuge tube 15ml  Falcon 352096
Conical centrifuge tube 50ml  Falcon 352070
DNAse   Sigma-Aldrich  4716728001
Fetal bovine serum  Biochrom S0115
Filter 30µm  Celltrics  400422316
FITC anti-mouse CD3 Antibody Biolegend  100203 AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)
Flow cytometry  BD-LSR Fortessa 
Forceps  Sigma-Aldrich  F4142-1EA
HBSS  Bioanalytic GmBH  085021-0500 
High-fat diet  SSNIF E15741–34  60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates
micro dissecting scissors  Sigma-Aldrich  S3146 used for dissection purposes 
PE anti-mouse CD25 Antibody Biolegend  101903 AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)
PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody Biolegend  104417 AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)
PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody Biolegend  107629 AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)
PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody Biolegend  100565 AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)
Percoll solution  Biochrom L6115
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody Biolegend  103031 AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody Biolegend  108427 AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)
Phosphate buffered saline  Gibco 12559069
Round-Bottom Tubes with cell strainer cap STEMCELL Technologies  38030
TruStain fcX anti-mouse CD16/32 Biolegend  101301 AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
Trypan Blue  Sigma-Aldrich  T6146
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend  423105 viablity stain 

References

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Cite This Article
Sbierski-Kind, J., Schmidt-Bleek, K., Streitz, M., Kath, J., Spranger, J., Volk, H. An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes. J. Vis. Exp. (146), e59470, doi:10.3791/59470 (2019).

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