מודל Murine מתקדם לאגודה לדלקת כבד Nonatoin עם סוכרת מסוג 2
Summary
דיאטה פשוטה ואמינה המושרה בעלי חיים מכרסם מודל עבור steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש) מתואר, מושגת באמצעות דיור ללא SPF של בעלי חיים וניהול של תזונה מסוימת גבוהה שומן. אנו מתארים זיהוי של תת הכבד והאדיפוז מערכות המשנה של תאים חיסוניים כדי ללכוד את התנאים האימונולוגיים אנושיים על ידי חשיפת עכברים חיידקים סביבתיים.
Abstract
השמנת יתר קשורה לדלקת כרונית בדרגה נמוכה ועמידות לאינסולין, לתרום לשכיחות הולכת וגוברת של מחלות מטבולית כרונית, כגון סוכרת סוג 2 ו steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש). מחקרים שאירעו לאחרונה הקימה כי תאי החיסון הפרו דלקתיים לחדור יפרטרופית שמנים רקמות והכבד. בהינתן החשיבות המתעוררים של תאים חיסוניים בהקשר של הומאוסטזיס מטבולית, יש צורך קריטי לכמת ולאפיין את השינוי שלהם במהלך התפתחות של סוכרת מסוג 2 ו נאש. עם זאת, מודלים בעלי חיים היגרמו לתכונות הפתותולוגיות האופייניות של האדם נאש הם דלילים.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את ערכות המשנה של תאים חיסוניים מבודדים מן הכבד ואת רקמת השומן במודל העכבר האמין של נאש, שהוקמה על ידי הדיור דיאטה גבוהה שומן (HFD) עכברים תחת לא ספציפי הפתוגן ללא מצבים (SPF) תנאים ללא מכשול למשך שבעה שבועות לפחות. אנו להדגים את הטיפול של עכברים בתנאים שאינם SPF, העיכול של רקמות וזיהוי של מקרופאגים, הרוצח הטבעי (NK) תאים, תאים דנדריטים, B ו-T קבוצות ממשנה של תאים על ידי הזרמת cy, לנסות. זרם מייצג cy, לנסות מגרשים מעכברי SPF HFD ועכברים שאינם SPF מסופקים. כדי להשיג נתונים אמינים ומתרגם, שימוש בנוגדנים, שיטות מדויקות ומדויקות לעיכול רקמות והמשך הניסויים הנכונים בזרימה cy, לנסות הם אלמנטים קריטיים.
ההתערבות כדי לשחזר את החשיפה אנטיגן פיזיולוגי בעכברים על ידי דיור אותם בתנאים שאינם SPF וחשיפה לא ספציפית אנטיגנים חיידקים יכול לספק כלי רלוונטי לחקירת הקשר בין שינויים אימונולוגיים, המושרה דיאטה השמנת יתר וסיבוכים הקשורים לטווח ארוך.
Introduction
השמנת יתר היא הפרעה רב עצרת וגורם סיכון מרכזי לפיתוח מחלות לב, שבץ, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש), סוכרת סוג 2 (T2D) וכמה סוגים של סרטן. השכיחות של השמנת יתר הוא גדל במהירות ברחבי העולם. כיום, 2,100,000,000 אנשים – כמעט 30% מאוכלוסיית העולם-הם שמנים או שמנים1. השמנת יתר הקשורות לאינסולין יכול להוביל T2D, כאשר מותש תאי ביתא איון הלבלב לא לפצות על הצורך מוגבר לאינסולין כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז2.
רקמת אדיפוז מורכבת מסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, תאי אנדותל, פיברותקיעות ותאי החיסון. במהלך התקדמות של השמנת יתר, שינויים במספר והפעילות של תאים חיסוניים יכול להוביל דלקת בדרגה נמוכה של יפרטרופית אדיפוז3,4. באופן ספציפי, זה נמצא כי צריכת אנרגיה מוגזמת, מלווה ברמות גבוהות באופן כרוני של גלוקוז בדם, טריגליצרידים וחומצות שומן חינם, מוביל היפוקסיה adipocyte, המתח רשתית העין, לקויי תפקוד מיטוכונדריאלי ו הפרשת ציטוקין משופרת, וכתוצאה מכך הפעלת התאים החיסוניים הפרו-דלקתיים5,6. מחקר בעבר התמקד בעיקר בחסינות מולדת, אבל לאחרונה תאים חיסוניים גמישים (T ו-B תאים) התפתחה כרגולטורים חשובים של הומאוסטזיס גלוקוז. הם בעלי דלקתיות (כולל CD8+ T תאים, Th1, ו B תאים) או בעיקר פונקציות רגולטוריות (כולל הרגולציה T (treg) תאים, Th2 תאים) והוא יכול גם להחמיר או להגן מפני תנגודת לאינסולין7,8 , . בסדר, תשע
יתר על כן, מנגנונים מספר הוצעו כדי להסביר כיצד השמנת יתר מגדילה, כולל ייצור מוגבר של ציטוקינים על ידי האדיפוז רקמה10. נאש, הצורה המתקדמת של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי ונטל בריאות מרכזי במדינות מפותחות, הוא מאופיין באופן היסטולוגית על ידי הבלון בלונים, הצטברות ליפיד, פיברוזיס ודלקת לוצלתית ועשוי להתקדם ל שחמת, בסוף מחלת כבד שלב או סרטן hepatocellular. משטר מספר (למשל מתיונין ותזונה לקויה כולין11) ידועים לגרום נאש כמו מחלות כבד במודלים בעלי חיים לא אנושיים, אבל רוב הגישות הללו לא לכידה של התנאים האנושיים של נאש ואת מטבולית תוצאות כפי שהם דורשים הסתרה גנטית ספציפית, שאינם פיזיולוגיים מניפולציות תזונתיים או חוסר עמידות לאינסולין אופייני של האדם נאש. יתר על כן, ההבנה שלנו של המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבולית מבוססת כיום על ניסויים שבוצעו עם עכברי מעבדה שוכנו תחת תקן הפתוגן הספציפי ללא המחלה (SPF). מתקני מכשול אלה הם היגיינה באופן חריג לא לשקול את החיידקים מגוון בני אדם צריך להיתקל, אשר עשוי להסביר את הקשיים בתהליך התרגום של מחקרי בעלי חיים לגישות קליניות12,13 , . ארבע עשרה
כדי לחקור את ערכות המשנה של התא החיסונית השונים ברקמת השומן והכבד במהלך התפתחות עמידות לאינסולין ונאש במודל עכבר מתקדם לשחזר את התנאים האימונולוגיים אנושיים, עכברים שוכנו בכלובים בודדים בחצי סטרילי תנאים ללא מחסום. עכברים שוכנו תחת התנאים נחשף אנטיגן פיתחה נאש כמו הכבד פתולוגיה כבר אחרי 15 שבועות של דיאטה גבוהה שומן (HFD) האכלה13. בהשוואה לגיל המתאים עכברי SPF הם פיתחו stevesiרומטוזיס, חדירת הכבד הפעלה של תאים חיסוניים.
כתב יד זה מתאר זרימה חזקה cy, לנסות ניתוח להגדיר ולספור את תת הקבוצות של תאים החיסונית של רקמת שומן העכבר והכבד במודל של נאש. הניתוח הסייטונסה לזרום מאפשר זיהוי של פרמטרים מרובים של תאים בודדים בו בניגוד ל-RT-PCR או גישות אימונוהיסטוכימיה.
לסיכום, המחקר שלנו מציע מודל העכבר של HFD לטווח קצר עבור חקירת התפתחות עמידות לאינסולין ו נאש ואת המנגנונים הבסיסיים המוצגים גם נאמנות למצב האנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
Steatohepatitis יש קשר חזק עם חריגות מטבולית כגון השמנה, עמידות לאינסולין ו דיסליפידמיה15. מחקרים מרובים מצביעים על כך דלקת ברקמת אדיפוז יכול לנהוג בפתוגנזה של סוכרת סוג 2, כולל רמות שונות של תאים הן של המערכת החיסונית מולדת מסתגלת4,5,16</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Anke Jurisch, דיאנה וולנר, ד ר קתרין וייט ו קורנליה השמאן לקבלת סיוע בהליכים ניסיוניים ובנימין Tiburzy מ Biolegend על הערות מועילות על אסטרטגיית העליה. י. ס. ס. הייתה נתמכת על ידי מענק הלמהולץ (ICEMED). מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהיחידה למחקר קליני של מכון ברלין לבריאות (BIH), “BCRT-גרנט” על ידי משרד החינוך הגרמני הפדרלי של המחקר וקרן איינשטיין. K.S.-בי. ו-H.-D.V. ממומנים על ידי FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
