간단 하 고 신뢰할 수 있는 식이 유발 설치류 동물 모델에 대 한 무 알콜 지방 각 막 염 (내 쉬)에 대 한 설명, 동물의 비 SPF 주택을 통해 달성 하 고 특정 높은 뚱뚱한 다이어트의 관리. 우리는 마우스를 환경 세균에 노출 시 킴으로써 인간 면 역학적 조건을 다시 캡처하는 간 및 지방 면역 세포 하위 세트의 식별을 설명 합니다.
비만은 만성 저 학년 염증과 인슐린 저항성과 관련 되어 있으며, 2 형 당뇨병 및 무 알콜 수 막 염 (내 쉬)과 같은 만성 대사 질환의 증가 하는 보급에 기여 합니다. 최근의 연구는 프로 염증 성 면역 세포가 비만 비 대 지방 조직과 간을 침투 시키는 것을 확립 했습니다. 신진 대사 항상 성의 맥락에서 면역 세포의 새로운 중요성을 감안할 때, 타입-2 당뇨병과 내 시의 개발 중에 그들의 수정 사항을 정량화 하 고 특성화 하는 중요 한 필요가 있다. 그러나, 인간 내 쉬의 전형적인 병 태 생리학적 특징을 유도 하는 동물 모델은 희소 하다.
이 문서에서는, 우리 내 시의 신뢰할 수 있는 마우스 모델에서 간 및 지방 조직에서 고립 된 면역 세포 하위 집합을 식별 하는 자세한 프로토콜을 제공 합니다, 비 특이 적 병원 체 없는 (SPF) 조건 하에서 주택 고 지방 다이어트 (HFD) 마우스에 의해 설립 적어도 7 주 동안 장벽. 우리는 유 세포 분석기에 의해 비-SPF 조건에서 마우스의 처리, 조직의 소화 및 대 식 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 수지상 세포, B 및 T 세포 서브 세트의 식별을 입증 한다. SPF HFD 마우스 및 비 SPF 마우스의 대표적인 유 세포 분석 플롯이 제공 된다. 신뢰할 수 있고 해석할 데이터를 얻기 위해 항 체의 사용, 조직 소화를 위한 정확 하 고 정밀한 방법 및 유 세포 분석 실험에서의 적절 한 게이팅을 중요 한 요소입니다.
미생물 항 원에 대 한 비-SPF 조건에서 그들을 주택에 의해 쥐에 있는 생리 적 항 원 노출을 복원 하는 내정간섭은 면역학 변경 사이 링크를 조사 하기를 위한 관련 도구를 제공할 수 있었습니다, 규정식에 의하여 유도 된 비만과 관련 된 장기 합병증.
비만은 심장 병, 치기, 무 알콜 항 암 각 막 염 (내 시), 타입-2 당뇨병 (T2D) 및 몇몇 유형의 암의 발달을 위한 다 인 성과 무질서 및 중요 한 위험 요소입니다. 비만의 보급은 급속 하 게 세계적으로 증가 하 고 있습니다. 오늘날 세계 인구의 약 30%가 21억 명이 비만 또는과 체중1입니다. 비만-관련 된 인슐린 저항은 포도 당 항상성2를 유지 하는 인슐린을 위한 증가 한 필요를 보충 하기 위하여 췌 장 섬 베타 세포가 소진 될 때 T2D로 이끌어 낼 수 있습니다.
지방 조직은 지방 세포를 포함 하는 다양 한 세포 유형으로 구성 되어 있으며, 내 피 셀, 섬유 아 세포 및 면역 세포. 비만의 진행 도중, 면역 세포의 수 그리고 활동에 있는 변경은 비 대 성 지방 조직3의 저급 한 염증을 이끌어 낼 수 있습니다,4. 구체적으로, 과도 한 에너지 섭취는 혈당, 중성 지방 및 유리 지방산의 만성 상승 수준을 동반 하 고, 지방 세포 저 산소 증, 내 소포체 스트레스, 손상 된 미토 콘 드리 아 기능 및 향상 된 사이토카인 분 비, 염증 성 지방 면역 세포의 활성화의 결과5,6. 과거 연구는 주로 선천적인 면제에 집중 했습니다, 그러나 더 최근에 적응 하는 면역 세포 (T와 B 세포)는 포도 당 항상성의 중요 한 규칙으로 부상 했습니다. 그들은 염증 성 (CD8+ t 세포, Th1 및 B 세포 포함) 또는 주로 조절 기능 (규제 T (treg) 세포, Th2 세포 포함)을 소유 하 고 인슐린 저항성을 악화 시키거나 보호 할 수 있습니다7,8 , 9.
또한, 지방 조직10에의 한 사이토카인의 증가 된 생산을 포함 하 여 비만이 증가 하는 방법을 설명 하기 위해 여러 가지 기전이 제안 되었다. 내 쉬, 무 알콜 지방 간 질환의 진보적 인 형태와 선진국의 주요 건강 부담은, 조직 학적으로 풍 화 된 간세포, 지질 축적, 섬유 증 및 연골 염을 특징으로 하 고 진행 될 수 있다 간 경 변, 단 부 질환 또는 간세포 암 종. 몇몇 식이요법 (예를 들면 메티오닌과 콜린 결핍 다이어트11)은 비 인간 동물 모델에서 내 시 같은 간 병리학을 유도 하는 것으로 알려져 있지만, 이러한 접근법의 대부분은 내 쉬와 그 대사에 대 한 인간의 상태를 탈환 하지 않는다 그들은 특정 유전자 녹아웃을 필요로 하는 결과, 비 생리 식이 조작 또는 인간의 내 쉬의 전형적인 인슐린 저항이 부족. 또한, 신진 대사 질환의 근본적인 메커니즘에 대 한 우리의 이해는 현재 표준 특정 병원 체 무료 (SPF) 조건 하에 보관 된 실험실 마우스를 사용 하 여 수행 된 실험을 기반으로 합니다. 이러한 장벽 시설은 비정상적으로 위생 적 이며 인간 들이 겪는 미생물 다양성을 고려 하지 않으며,이는 임상 접근법에 대 한 동물 연구의 번역 과정에서 어려움을 고려할 수 있는12,13 , 14.
인간 면 역학적 상태를 재생 하는 고급 마우스 모델에서 인슐린 저항성 및 내 시를 개발 하는 동안 지방 조직과 간에 서 상이한 면역 세포 서브 세트를 조사 하기 위해, 마우스를 반 멸 균 된 개별 케이지 내에 수납 하였다 장벽 없는 조건. 항 원 노출 조건 하에 보관 된 마우스는 이미 15 주 동안 고 지방 식이 요법 (HFD)을 먹이는13의 후 내 시 같은 간 병리학을 개발 했습니다. 그들은 나이 일치 하는 SPF 마우스에 비해 그들은 거 대 한 신경 병 증을 개발, 간 침투 및 면역 세포의 활성화.
이 원고는 내 시의 모델에서 마우스 지방 조직과 간에 서 면역 세포 서브 세트를 정의 하 고 계산 하는 강력한 유 세포 분석을 설명 합니다. 유 세포 분석기 분석은 RT-PCR 또는 면역 조직 화학 접근법과 달리 개별 세포의 여러 파라미터를 동시에 검출할 수 있게 합니다.
요약 하자면, 우리의 연구는 인슐린 저항과 내 쉬의 개발과 또한 인간의 상태에 대 한 충실도를 나타내는 기본 메커니즘을 조사 하기 위한 단기 HFD의 마우스 모델을 제공 합니다.
스 테아의 각 막 염은 비만, 인슐린 저항성 및 dyslipidemia15와 같은 대사 이상과 강한 연관이 있다. 여러 연구에 따르면, 지방 조직 염증은 선천적인 면역계와 적응형 면역 체계의 세포의 변화 된 수준을 포함 하 여 타입-2 당뇨병의 병 인을 구동할 수 있다는 것을 나타냅니다.4,5,17 . 또?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 Anke Jurisch, 다이아나 워 너, 닥터 카 린 위 테와 코르넬리아 헥 트만에 게 도움을 요청 하 여 바이오 레 전 드에서 Tiburzy 하는 실험 절차와 벤자민에 대 한 도움이 되는 정보를 제공 하 여 게이팅 전략에 대 한 의견을 주었다. J.S.는 헬름홀츠 교부 금 (ICEMED)에 의해 지지 되었다. 이 연구는 베를린 건강 연구소의 임상 연구 단위에서 보조금에 의해 지원 되었다 (BIH), “BCRT 보조금” 독일 연방 교육부와 연구와 아인슈타인 재단에 의해. K.S.-B. 그리고 h.-D.V.는 FOR2165에 의해 후원 된다.
100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
1ml syringe | BD | 309659 | |
26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |