Summary

Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes

Published: April 26, 2019
doi:

Summary

Es wird ein einfaches und zuverlässiges, diächterinduziertes Zäuntiermodell für alkoholfreie Steatohepatitis (NASH) beschrieben, das durch das nicht-SPF-Gehäuse der Tiere und die Verabreichung einer bestimmten fettreichen Ernährung erreicht wird. Wir beschreiben die Identifizierung von Leber-und Fettzell-Subsets, um die menschlichen Immunbedingungen zu rekapitulieren, indem Mäuse Umweltkeimen aussetzen.

Abstract

Fettleibigkeit wird mit chronischen, minderwertigen Entzündungen und Insulinresistenz in Verbindung gebracht, was zu einer zunehmenden Prävalenz chronischer Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) beiträgt. Neuere Forschungen haben ergeben, dass entzündungshemmende Immunzellen fettleibiges hypertrophisches Fettgewebe und Leber infiltrieren. Angesichts der sich abzeichnenden Bedeutung von Immunzellen im Zusammenhang mit der metabolischen Homöostase ist es dringend erforderlich, ihre Veränderung bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes und NASH zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tiermodelle, die für die menschliche NASH typische pathophysiologische Merkmale hervorrufen, sind jedoch spärlich.

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Immunzellen-Teilmengen zu identifizieren, die von der Leber und dem Fettgewebe isoliert sind, in einem zuverlässigen Mausmodell von NASH, das durch die Unterbringung von fettreichen Diät-Mäusen (HFD) unter unspezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen ohne Sperre für mindestens sieben Wochen. Wir zeigen den Umgang mit Mäusen unter nicht-seften Bedingungen, die Verdauung des Gewebes und die Identifizierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK), dendritischen Zellen, B und T-Zell-Untergruppen durch Fließzytometrie. Repräsentative Flow-Zytometrie-Parzellen von SPF-HFD-Mäuse und Nicht-SPF-Mäusen werden zur Verfügung gestellt. Um verlässliche und interpretierbare Daten zu erhalten, sind der Einsatz von Antikörpern, präzisen und präzisen Methoden zur Gewebeverdauung und der richtigen Gattung in Strömungszytometrie-Experimenten entscheidende Elemente.

Der Eingriff zur Wiederherstellung der physiologischen Antigen-Exposition bei Mäusen, indem er sie unter nicht-slawischen Bedingungen unterbringt, und die unspezifische Exposition gegenüber mikrobiellen Antigenen könnten ein relevantes Instrument zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen immunologischen Veränderungen sein, die durch die Ernährung verursacht werden. Fettleibigkeit und damit verbundene Langzeitkomplikationen.

Introduction

Fettleibigkeit ist eine multifaktorielle Erkrankung und ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Herzerkrankungen, Schlaganfall, alkoholfreier Steatohepatitis (NASH), Typ-2-Diabetes (T2D) und einigen Krebsarten. Die Verbreitung von Fettleibigkeit nimmt weltweit rapide zu. Heute sind 2,1 Milliarden Menschen — fast 30% der Weltbevölkerung — entweder fettleibig oder übergewichtig1. Fettleibig-assoziierte Insulinresistenz kann zu T2D führen, wenn erschöpfte Bauchspeicheldrüsen-Beta-Zellen den erhöhten Bedarf an Insulin zur Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase2nicht kompensieren.

Das Fettgewebe besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Adipozyten, Endothelzellen, Fibroblasten und Immunzellen. Während des Fortschritts der Fettleibigkeit können Veränderungen in der Anzahl und Aktivität von Immunzellen zu einer minderwertigen Entzündung des hypertrophischenFettgewebes 3,4führen. Konkret wurde festgestellt, dass eine übermäßige Energieaufnahme, begleitet von chronisch erhöhten Blutzuckerwerten, Triglyceriden und freien Fettsäuren, zu Adipozyten-Hypoxie, endoplasmatischer Retikelstress, beeinträchtigter Mitochondrien-Funktion und Verstärkten die Cytokin-Sekretion, was zur Aktivierung von entzündungshemmenden Fettzellen5,6führt. Die bisherigen Forschungen haben sich vor allem auf die angeborene Immunität konzentriert, aber in jüngerer Zeit haben sich adaptive Immunzellen (T und B-Zellen) als wichtige Regulatoren der Glukose-Homöostase herausgebildet. Sie verfügen über entzündliche Funktionen (einschließlich CD8+ T-Zellen, Th1 und B-Zellen) oder vor allem über regulatorische Funktionen (einschließlich regulatorischer T (Treg) Zellen, Th2-Zellen) und können sowohldie Insulinresistenz von7,8 verschärfen noch schützen. , 9. September

Darüber hinaus wurden mehrere Mechanismen vorgeschlagen, um zu erklären, wie Fettleibigkeit die Steatohepatitis erhöht, einschließlich der erhöhten Produktion von Zytokinen durch Fettgewebe 10. NASH, die fortschreitende Form der alkoholfreien Fettlebererkrankung und eine große gesundheitliche Belastung in den Industrieländern, ist histologisch durch aufgeblasene Hepatozyten, Fettansammlungen, Fibrose und pericelluläre Entzündungen gekennzeichnet und kann sich fortentwickeln, um Zirrhose, Lebererkrankung im Endstadium oder hepatokelluläres Karzinom. Mehrere Regimen (zum Beispiel die Methion-und Cholin-Mangelnahrung 11) sind dafür bekannt, dass sie in nicht-menschlichen Tiermodellen eine NASH-ähnliche Leberpathologie hervorrufen, aber die meisten dieser Ansätze rekapitulieren die menschlichen Bedingungen der NASH und ihrer Stoffwechsels nicht. Konsequenzen, da sie entweder einen spezifischen Genknockout, nicht-physiologische Ernährungsmanipulationen oder keine Insulinresistenz erfordern, die typisch für die menschliche NASH ist. Darüber hinaus basiert unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen von Stoffwechselerkrankungen derzeit auf Experimenten, die mit Labormäusen durchgeführt werden, die unter den üblichen pathogenfreien (SPF) Bedingungen untergebracht sind. Diese Barriereanlagen sind ungewöhnlich hygienisch und berücksichtigen nicht die mikrobielle Vielfalt, auf die der Mensch stoßen muss, was für Schwierigkeiten im Übersetzungsprozess von Tierstudien zu klinischen Ansätzen 12, 13 verantwortlich sein kann. , 14.

Um die verschiedenen Immunzelluntergruppen in Fettgewebe und Leber bei der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH in einem fortgeschrittenen Mausmodell zu untersuchen, das menschliche Immunbedingungen reproduziert, wurden Mäuse in einzelnen Käfigen in halbsterilen Bedingungen ohne Barriere. Mäuse, die unter Antigen-exponierten Bedingungen untergebracht waren, entwickelten bereits nach 15 Wochen fettreicher Ernährung(HFD) eine NASH-ähnliche Leberpathologie. Im Vergleich zu altersgerechten SPF-Mäusen entwickelten sie makrovesikuläre Steatose, Leberinfiltration und Aktivierung von Immunzellen.

Dieses Manuskript beschreibt eine robuste Strömungszytometrie-Analyse, um Immunzellen-Teilmengen aus dem Fettgewebe und der Leber der Maus in einem Modell von NASH zu definieren und zu zählen. Die Strömungszytometrie-Analyse ermöglicht die Ermittlung mehrerer Parameter einzelner Zellen gleichzeitig im Gegensatz zu RT-PCR oder Immunhistochemie-Ansätzen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Studie ein Mausmodell der kurzfristigen HFD zur Untersuchung der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH sowie den zugrundeliegenden Mechanismen bietet, die auch die Treue zum menschlichen Zustand aufweisen.

Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren der Nationalen Gesundheitsinstitute und des Tierschutzgesetzes unter der Aufsicht unseres institutionellen Tierschutzausschusses durchgeführt. Die Tierprotokolle wurden nach institutionalethischen Richtlinien der Charité Berlin durchgeführt und vom Landesamt für Gesundheit und Soziales genehmigt und entsprechen den ARRIVE-Richtlinien. 1. Diät-induziertes Tiermodell der Steatohepatitis <o…

Representative Results

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Charakterisierung von Oberflächenmarkern angeborener und adaptiver Immunzellen, die von murem perigonadalem Fettgewebe und Leber in einem Modell der Diät-induzierten NASH isoliert sind. Bei diesem Modell wurde NASH durch die Verabreichung von HFD plus Saccharose (6%) induziert. 7 bis 15 Wochen im Trinkwasser in C57Bl/6J Mäuse, wie zuvor berichtet 13. Wichtig ist, dass Mäuse in halbsterilen Bedingungen untergebracht waren und daher während des gesamte…

Discussion

Die Steatohepatitis hat eine starke Verbindung mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie15. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass eine Fettgewebe-Entzündung die Pathogenese von Typ-2-Diabetes antreiben kann, einschließlich veränderter Zellwerte sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems 4,5,16, 17 . Darüber hi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte und Cornelia Heckmann für die Unterstützung bei experimentellen Verfahren und Benjamin Tiburzy von Biolegend für hilfreiche Kommentare zur Gating-Strategie. J.S. wurde vom Helmholtz Grant (ICEMED) unterstützt. Die Studie wurde durch Stipendien der Klinischen Forschergruppe des Berliner Instituts für Gesundheit (BIH), des “BCRT-Stipendiums” des Bundesministeriums für Bildung und Forschung und der Einstein-Stiftung unterstützt. K.S.-B. Und H.-D.V. wird von FOR2165 finanziert.

Materials

100µm cell strainers  Falcon 352340
1ml syringe  BD   309659
26G x 5/8 needles  BD  305115
35mm Petri Dishes  Falcon 353001
40µm cell strainers  Falcon 352340
ACK lysis buffer  GIBCO A1049201
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Biolegend  103127 AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)
Analysis software  FlowJo 10.0.8 software
APC anti-mouse CD11c Antibody Biolegend  117309 AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)
APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody Biolegend  138411 AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)
BV421 anti-mouse CD127 Antibody Biolegend  135023 AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)
BV421 anti-mouse F4/80 Antibody Biolegend  123131 AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)
BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody Biolegend  135219 AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)
BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody Biolegend  108739 AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)
BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody Biolegend  101239 AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)
BV711 anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend  103255 AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)
BV785 anti-mouse CD8a Antibody Biolegend  100749 AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)
C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old  Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2  Charité – Universitätsmedizin Berlin A119.1 
Collagenase NB 4G Proved Grade  SERVA  11427513
Collagenase Typ I  Worthington  LS004197
Conical centrifuge tube 15ml  Falcon 352096
Conical centrifuge tube 50ml  Falcon 352070
DNAse   Sigma-Aldrich  4716728001
Fetal bovine serum  Biochrom S0115
Filter 30µm  Celltrics  400422316
FITC anti-mouse CD3 Antibody Biolegend  100203 AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)
Flow cytometry  BD-LSR Fortessa 
Forceps  Sigma-Aldrich  F4142-1EA
HBSS  Bioanalytic GmBH  085021-0500 
High-fat diet  SSNIF E15741–34  60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates
micro dissecting scissors  Sigma-Aldrich  S3146 used for dissection purposes 
PE anti-mouse CD25 Antibody Biolegend  101903 AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)
PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody Biolegend  104417 AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)
PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody Biolegend  107629 AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)
PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody Biolegend  100565 AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)
Percoll solution  Biochrom L6115
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody Biolegend  103031 AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody Biolegend  108427 AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)
Phosphate buffered saline  Gibco 12559069
Round-Bottom Tubes with cell strainer cap STEMCELL Technologies  38030
TruStain fcX anti-mouse CD16/32 Biolegend  101301 AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
Trypan Blue  Sigma-Aldrich  T6146
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend  423105 viablity stain 

References

  1. Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
  2. Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
  3. Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
  5. Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
  6. Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
  7. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
  8. Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  9. Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
  10. Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
  11. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  12. Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  13. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
  14. Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
  15. Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
  16. McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
  17. Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
  18. Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
  19. Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
  20. Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
  21. Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).

Play Video

Cite This Article
Sbierski-Kind, J., Schmidt-Bleek, K., Streitz, M., Kath, J., Spranger, J., Volk, H. An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes. J. Vis. Exp. (146), e59470, doi:10.3791/59470 (2019).

View Video