Summary

Identificación de factores nucleolares durante la replicación del VIH-1 a través de la inmunoprecipitación de rev y la espectrometría de masas

Published: June 26, 2019
doi:

Summary

Aquí describimos la inmunoprecipitación Rev en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los métodos descritos pueden utilizarse para la identificación de factores nucleolares implicados en el ciclo infeccioso VIH-1 y son aplicables a otros modelos de enfermedades para la caracterización de vías poco estudiadas.

Abstract

El ciclo infeccioso VIH-1 requiere interacciones virales con proteínas con factores de huésped para facilitar la replicación viral, el empaquetado y la liberación. El ciclo infeccioso requiere además la formación de complejos proteicos virales/huésped con ARN VIH-1 para regular el empalme y permitir el transporte nucleocitolasmático. La proteína HIV-1 Rev logra la exportación nuclear de ARNM VIH-1 a través de la multimerización con objetivos de acción cisintrónicos – el elemento de respuesta Rev (RRE). Existe una señal de localización nucleolar (NoLS) dentro del coOH-terminus del motivo rico en arginina Rev (ARM), permitiendo la acumulación de complejos Rev/RRE en el nucleolus. Se especula con factores nucleolares para apoyar el ciclo infeccioso del VIH-1 a través de varias otras funciones, además de mediar la exportación nuclear independiente del ARNm y el empalme. Describimos un método de inmunoprecipitación de Rev de tipo salvaje (WT) en comparación con las mutaciones nucleolares Rev (deleción y mutaciones Rev-NoLS de un solo punto) en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los factores nucleolares implicados en el transporte nucleocitotoplasm (nucleophosmin B23 y nucleolin C23), así como los factores de empalme celular, pierden la interacción con Rev en presencia de mutaciones Rev-NoLS. Se identifican otros factores nucleolares, como el esnoRNA C/D 58, para perder la interacción con las mutaciones de Rev, pero su función en el ciclo de replicación del VIH-1 sigue siendo desconocida. Los resultados presentados aquí demuestran el uso de este enfoque para la identificación de factores nucleolares virales/anfitriones que mantienen el ciclo infeccioso VIH-1. Los conceptos utilizados en este enfoque son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades que requieren la caracterización de vías poco estudiadas.

Introduction

El núcleo se postula como el suelo de interacción de varios factores de huésped celular y virales necesarios para la replicación viral. El núcleo es una estructura compleja subdividida en tres compartimentos diferentes: el compartimento fibrilar, el compartimento fibrilar denso y el compartimento granular. La proteína HIV-1 Rev se localiza específicamente dentro de compartimentos granulares; sin embargo, se desconoce la razón de este patrón de localización. En presencia de mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones de Rev 4, 5 y 6), Rev mantiene un patrón nucleolar y se ha demostrado previamente para rescatar la replicación del VIH-1HXB2, sin embargo, con una eficiencia reducida en comparación con WT Rev1 . Todas las mutaciones de un solo punto son incapaces de sostener el ciclo infeccioso VIH-1NL4-3. En presencia de múltiples mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones De Rev-NoLS 2 y 9), se ha observado que Rev se dispersa por todo el núcleo y el citoplasma y no ha podido rescatar la replicación del VIH-1HXB2 1. El objetivo de este estudio proteómico es descifrar factores celulares nucleolares y no nucleolares involucrados en la vía infecciosa VIH-1 mediada por Rev. Las condiciones de inmunoprecipitación de Rev se optimizan mediante la interacción con la fosfoproteína nucleolar B23, que previamente se ha demostrado que pierde la interacción con Rev en presencia de mutaciones nucleolares.

Los factores celulares Rev han sido ampliamente estudiados en el pasado; sin embargo, esto se ha hecho en ausencia de patogénesis viral. Una proteína, en particular, que se caracteriza en este estudio a través de la interacción Rev durante la replicación del VIH-1 es la fosfoproteína nucleolar B23 – también llamada nucleofosmina (NPM), numatrina, o NO38 en anfibios2,3, 4. B23 se expresa como tres isoformas (NPM1, NPM2 y NPM3) – todos los miembros de la familia de chaperosina nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmina5,6. El chaperosón molecular NPM1 funciona en el montaje adecuado de nucleosomas, en la formación de complejos proteicos/ácidos nucleicos implicados en las estructuras de alto orden de cromatina7,8, y en la prevención de la agregación y el desdoblamiento erróneo de las proteínas diana a través de un dominio del núcleo N-terminal (residuos 1-120)9. La funcionalidad NPM1 se extiende a la génesis ribosoma a través del transporte de partículas preribosomales entre el núcleo y el citoplasma10,11, el procesamiento del ARN preribosomal en la secuencia del espaciador transcrito interno 12,13, y la detención de la agregación nucleolar de proteínas durante el ensamblaje ribosomal14,15. NPM1 está implicado en la inhibición de la apoptosis16 y en la estabilización de los supresores tumorales ARF17,18 y p5319,revelando su doble papel como factor oncogénico y supresor tumoral. NPM1 participa en las actividades celulares de estabilidad del genoma, replicación centrosoma y transcripción. NPM1 se encuentra en nucleólidos durante la interfase del ciclo celular, a lo largo de la periferia cromosómica durante la mitosis, y en cuerpos prenucleolares (PNB) al final de la mitosis. NPM2 y NPM3 no están tan bien estudiados como NPM1, que sufre niveles alterados de expresión durante la neoplasia maligna20.

NPM1 está documentado en el cierre nucleocitotoplasmático de varias proteínas nucleares/nucleolares a través de un NES interno y NLS9,21 y se informó previamente para impulsar la importación nuclear de proteínas VIH-1 Tat y Rev. En presencia de las proteínas de fusión B23-binding-domain—galactosidase, Tat localiza erróneamente dentro del citoplasma y pierde la actividad de transactivación; esto demuestra una fuerte afinidad de Tat para B232. Otro estudio estableció un complejo estable Rev/B23 en ausencia de ARNm que contienen RRE. En presencia de ARNm RRE, Rev se disocia de B23 y se une preferentemente al VIH RRE, lo que conduce al desplazamiento de B2322. Se desconoce dónde, a nivel subnuclear, se lleva a cabo la transactivación de Tat y el proceso de intercambio de Rev de B23 por ARNm del VIH. Ambas proteínas se postulan para entrar en el nucleolus simultáneamente a través de la interacción B23. Se espera la participación de otras proteínas celulares del huésped en la vía nucleolar del VIH. Los métodos descritos en esta investigación proteómica ayudarán a dilucidar la interacción del nucleol con los factores celulares del huésped involucrados durante la patogénesis del VIH-1.

La investigación proteómica se inició a través de la expresión de mutaciones de un solo punto Rev NoLS (M4, M5 y M6) y múltiples sustituciones de arginina (M2 y M9) para la producción de VIH-1HXB2. En este modelo, una línea celular HeLa que expresa establemente la VIH-1HXB2 (HLfB) deficiente de Rev está transllenada de mutaciones nucleolares WT Rev y Rev que contienen una etiqueta de bandera al final de los 3′. La presencia de WT Rev permitirá que se produzca replicación viral en el cultivo HLfB, en comparación con las mutaciones Rev-NoLS que no rescatan la deficiencia de Rev (M2 y M9), o permiten que se produzca la replicación viral, pero no tan eficientemente como WT Rev (M4, M5 y M6)1. El lisato celular se recoge 48 horas más tarde después de la proliferación viral en presencia de la expresión Rev y se somete a inmunoprecipitación con un tampón de lisis optimizado para la interacción Rev/B23. Se describe la optimización del tampón de lisis utilizando diferentes concentraciones de sal, y los métodos de elución de proteínas para HIV-1 Rev se comparan y analizan en geles SDS-PAGE teñidos de plata o coomassie. El primer enfoque proteómico implica el análisis directo de una muestra eluida de WT Rev, M2, M6 y M9 expresados por espectrometría de masas en tándem. Un segundo enfoque por el cual los eludos de WT Rev, M4, M5 y M6 se sometieron a un proceso de extracción de gel se compara con el primer enfoque. Se analiza la afinidad de péptidos con las mutaciones Rev-NoLS en comparación con WT Rev y se muestra la probabilidad de identificación de proteínas. Estos enfoques revelan factores potenciales (nucleolar y no nucleolar) que participan en el transporte y empalme de ARNm VIH-1 con Rev durante la replicación del VIH-1. En general, las condiciones de lisis celular, IP y elución descritas son aplicables a las proteínas virales de interés para la comprensión de los factores celulares del huésped que activan y regulan las vías infecciosas. Esto también es aplicable al estudio de los factores de huésped celular necesarios para la persistencia de varios modelos de enfermedad. En este modelo proteómico, HIV-1 Rev IP está optimizado para la interacción B23 a factores nucleolares dilucidos involucrados en la actividad de cierre nucleocitolasmático y la unión de ARNm VIH-1. Además, se pueden desarrollar líneas celulares que expresan establemente modelos de enfermedades infecciosas que son deficientes para las proteínas clave de interés, similara a la línea celular HLfB, para estudiar las vías infecciosas de interés.

Protocol

1. Cultivo celular Mantener HLfB en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato sódico dentro de placas de 100 mm tratadas con cultivo de tejido. Mantener los cultivos celulares a 37oC en una incubadora humidificada suministrada con 5% de CO2. Paso de células confluentes a una densidad celular de 1 x 106 celdas/ml. Deseche los medios de cultivo celular. Enjuague suavemente las célul…

Representative Results

Las mutaciones de arginina de un solo punto y de punto múltiple Rev-NoLS, correspondientes a una variedad de patrones de localización subcelular, se examinaron en su capacidad de interactuar con los factores de host celular en comparación con WT Rev. WT Rev-3’flag y pcDNA-flag vector se expresaron en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir del lisado celular total y se teñiron con reactivo de manchas de plata. Rev-NoLS-3’flag es detectable (aproximadamente 18 kDa) en tres condiciones …

Discussion

Se evaluaron análisis espectrométricos masivos que comparaban las mutaciones Rev-NoLS y WT Rev en presencia de VIH-1 para comprender los factores nucleolares involucrados en el ciclo de replicación viral. Esto identificaría los componentes nucleolares necesarios para la infectividad viral. Nucleolar B23 tiene una alta afinidad con Rev-NoLS y funciona en la localización nucleolar de Rev3 y transporte nucleocitotoplasmático de MRNAs 22 de VIH ligados a Rev. La afinidad …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen a la Dra. Barbara K. Felber y al Dr. George N. Pavlakis por la cultura adherente hlfB proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Programa de Investigación y Reactivo de Referencia sobre el SIDA, División del SIDA, Instituto Nacional de Alergia según la Alergia y Infeccioso Enfermedades (NIAID), NIH. Los autores también reconocen las fuentes financieras proporcionadas por los NIH, las Subvenciones AI042552 y AI029329.

Materials

Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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