Summary

Identifizierung von Nukleolar-Faktoren während der HIV-1-Replikation durch Rev-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie

Published: June 26, 2019
doi:

Summary

Hier beschreiben wir Rev-Immunpräzipitation in Gegenwart von HIV-1-Replikation für Massenspektrometrie. Die beschriebenen Methoden können zur Identifizierung von Nukleolar-Faktoren verwendet werden, die am HIV-1-Infektionszyklus beteiligt sind, und sind auf andere Krankheitsmodelle zur Charakterisierung unteruntersuchter Pfade anwendbar.

Abstract

Der HIV-1-Infektionszyklus erfordert virale Proteininteraktionen mit Wirtsfaktoren, um die Virusreplikation, Verpackung und Freisetzung zu erleichtern. Der infektiöse Zyklus erfordert ferner die Bildung von viralen/Host-Proteinkomplexen mit HIV-1-RNA, um das Spleißen zu regulieren und den nukleozytoplasmatischen Transport zu ermöglichen. Das HIV-1 Rev-Protein führt den nuklearen Export von HIV-1-mRNAs durch Multimerisierung mit intronnischen cis-wirkenden Targets – dem Rev-Reaktionselement (RRE) durch. Im COOH-Terminus des Rev arginin-reichen Motivs (ARM) existiert ein nukleolares Lokalisierungssignal (NoLS), das die Ansammlung von Rev/RRE-Komplexen im Zellkern ermöglicht. Nukleolar-Faktoren werden spekuliert, um den HIV-1-Infektionszyklus durch verschiedene andere Funktionen zu unterstützen, zusätzlich zur Vermittlung von mRNA-unabhängigem Nuklearexport und Spleißen. Wir beschreiben eine Immunpräzipitierungsmethode des WildenTyps (WT) Rev im Vergleich zu Rev-Nukleolar-Mutationen (Deletion und Single-Point Rev-NoLS-Mutationen) in Gegenwart von HIV-1-Replikation für Massenspektrometrie. Nukleolar-Faktoren, die in den nukleozytoplasmatischen Transport (Nucleophosmin B23 und Nucleolin C23) sowie zelluläre Splagenfaktoren involviert sind, verlieren die Interaktion mit Rev in Gegenwart von Rev-NoLS-Mutationen. Verschiedene andere Nukleolar-Faktoren, wie snoRNA C/D-Box 58, werden identifiziert, um die Wechselwirkung mit Rev-Mutationen zu verlieren, aber ihre Funktion im HIV-1-Replikationszyklus bleibt unbekannt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen die Anwendung dieses Ansatzes zur Identifizierung von viralen/hostennden Nukleolar-Faktoren, die den HIV-1-Infektionszyklus aufrechterhalten. Die in diesem Ansatz verwendeten Konzepte gelten für andere Virus- und Krankheitsmodelle, die die Charakterisierung unterstudierter Pfade erfordern.

Introduction

Der Nucleolus wird als Interaktionsgrund verschiedener zellulärer Wirts- und Virusfaktoren postuliert, die für die Virusreplikation erforderlich sind. Der Nucleolus ist eine komplexe Struktur, die in drei verschiedene Fächer unterteilt ist: das Fibrillarfach, das dichte Fibrillarfach und das Körnungsfach. Das HIV-1 Rev-Protein lokalisiert sich spezifisch in körnigen Kompartimenten; Der Grund für dieses Lokalisierungsmuster ist jedoch unbekannt. In Gegenwart von Einpunktmutationen innerhalb der NoLS-Sequenz (Rev-Mutationen 4, 5 und 6) behält Rev ein Nukleolar-Muster bei und hat sich zuvor gezeigt, dass es die HIV-1-HXB2-Replikation mit reduzierter Effizienz im Vergleich zu WT Rev 1 rettet. . Alle Einpunktmutationen sind nicht in der Lage, den HIV-1 NL4-3-Infektionszyklus aufrechtzuerhalten. In Gegenwart mehrerer Einzelpunktmutationen innerhalb der NoLS-Sequenz (Rev-NoLS-Mutationen 2 und 9) wurde beobachtet, dass Rev sich im gesamten Kern und Zytoplasma verteilte und nicht in der Lage war, die HIV-1HXB2-Replikation 1zu retten. Das Ziel dieser Proteomik-Studie ist es, Nukleolar sowie nichtnukleolarzelluläre Faktoren zu entschlüsseln, die am Rev-vermittelten HIV-1-Infektionsweg beteiligt sind. Rev Immunpräzipitationsbedingungen werden durch Interaktion mit dem Nukleolar B23 Phosphoprotein optimiert, das zuvor gezeigt hat, dass Die Wechselwirkung mit Rev in Gegenwart von Nukleolar-Mutationen zu verlieren.

Rev zelluläre Faktoren wurden in der Vergangenheit ausgiebig untersucht; Dies wurde jedoch ohne virale Pathogenese getan. Ein Protein, das in dieser Studie durch Rev-Interaktion während der HIV-1-Replikation charakterisiert wird, ist das Nukleolarphosphoprotein B23 – auch Nucleophosmin (NPM), Numatrin oder NO38 bei Amphibien2,3, 4. B23 wird als drei Isoformen (NPM1, NPM2 und NPM3) ausgedrückt – alle Mitglieder der Nucleophosmin/Nukleoplasmin-Kernchaperonfamilie5,6. Das Molekularchaperon NPM1 funktioniert bei der richtigen Montage von Nukleosomen, bei der Bildung von Protein-/Nukleinsäurekomplexen, die an Chromatin-Strukturen höherer Ordnung7,8, und bei der Verhinderung von Aggregation und Fehlfaltung von Zielproteinen durch eine N-Terminal-Kerndomäne (Rückstände 1-120)9. Die NPM1-Funktionalität erstreckt sich auf die Ribosomen-Genese durch den Transport von präribosomalen Partikeln zwischen Dem Nucleus und Demonplasma10,11, die Verarbeitung von präribosomaler RNA in der internen transkribierten Abstandssequenz 12,13, und die Nukleolar-Aggregation von Proteinen während der ribosomalen Montage14,15. NPM1 ist in die Hemmung der Apoptose16 und in die Stabilisierung der Tumorsuppressoren ARF17,18 und p5319verwickelt, was seine Doppelrolle als onkogener Faktor und Tumorsuppressor offenbart. NPM1 beteiligt sich an den zellulären Aktivitäten der Genomstabilität, Zentromatreplikation und Transkription. NPM1 findet sich in Nukleoli während der Zellzyklus-Interphase, entlang der chromosomalen Peripherie während der Mitose und in pränukleolaren Körpern (PNB) am Ende der Mitose. NPM2 und NPM3 sind nicht so gut untersucht wie NPM1, das während der Malignität20veränderte Expressionsniveaus durchläuft.

NPM1 ist in der nukleozytoplasmatischen Abschaltung verschiedener Kern-/Nukleolar-Proteine durch ein internes NES und NLS9,21 dokumentiert und wurde zuvor berichtet, dass sie den nuklearen Import von HIV-1-Tat- und Rev-Proteinen vorantreiben. In Gegenwart von B23-bindungs-Domain–Galactosidase-Fusionsproteinen, Tat misslokalisiert innerhalb des Zytoplasmas und verliert Transaktivierungsaktivität; dies zeigt eine starke Affinität von Tat für B232. Eine andere Studie stellte einen Rev/B23-Stabilen Komplex in Abwesenheit von RRE-haltigen mRNAs fest. In Gegenwart von RRE mRNA trennt sich Rev von B23 und bindet vorzugsweise an die HIV RRE, was zur Verschiebung von B2322führt. Es ist nicht bekannt, wo auf subnuklearer Ebene die Tat-Transaktivierung und der Rev-Austauschprozess von B23 gegen HIV mRNA stattfinden. Beide Proteine werden postuliert, um gleichzeitig durch B23-Wechselwirkung in den Zellkern einzudringen. Die Beteiligung anderer zellulärer Wirtsproteine in den HIV-Nukleolar-Weg wird erwartet. Die in dieser Proteomik-Untersuchung beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, das Zusammenspiel des Zellkerns mit den zellulären Wirtsfaktoren bei der HIV-1-Pathogenese aufzuklären.

Die Proteomik-Untersuchung wurde durch die Expression von Rev NoLS-Einpunktmutationen (M4, M5 und M6) und multiplen Argininsubstitutionen (M2 und M9) für die HIV-1-HXB2-Produktion eingeleitet. In diesem Modell wird eine HeLa-Zelllinie, die Rev-defizitieres HIV-1HXB2 (HLfB) stabil ausdrückt, mit WT Rev- und Rev-Nukleolarmutationen transfiziert, die ein Flag-Tag am Ende der 3 enthalten. Das Vorhandensein von WT Rev ermöglicht eine Virusreplikation in der HLfB-Kultur im Vergleich zu Rev-NoLS-Mutationen, die Rev-Mangel (M2 und M9) nicht retten oder eine Virusreplikation ermöglichen, aber nicht so effizient wie WT Rev (M4, M5 und M6)1. Das Zelllysat wird 48 h später nach viraler Proliferation in Gegenwart von Rev-Expression gesammelt und einer Immunpräzipitation mit einem Lysepuffer ausgesetzt, der für rev/B23-Interaktion optimiert ist. Lysepufferoptimierung mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen wird beschrieben und Proteinelutionsmethoden für HIV-1 Rev werden in silberbefleckten oder Coomassie-gebeizten SDS-PAGE-Gelen verglichen und analysiert. Der erste Proteomik-Ansatz beinhaltet die direkte Analyse einer eluierten Probe aus exprimierter WT Rev, M2, M6 und M9 durch Tandem-Massenspektrometrie. Ein zweiter Ansatz, bei dem die Eluate von WT Rev, M4, M5 und M6 einem Gelextraktionsprozess unterzogen werden, wird mit dem ersten Ansatz verglichen. Die Peptid-Affinität zu Rev-NoLS-Mutationen im Vergleich zu WT Rev wird analysiert und die Proteinidentifikationswahrscheinlichkeit angezeigt. Diese Ansätze zeigen potenzielle Faktoren (Nukleolar und Nonnukleolar), die an HIV-1 mRNA-Transport und Spleißen mit Rev während der HIV-1-Replikation teilnehmen. Insgesamt sind die beschriebenen Zelllyse-, IP- und Elutionsbedingungen auf virale Proteine von Interesse anwendbar, um die zellulären Wirtsfaktoren zu verstehen, die infektionseuchende Bahnen aktivieren und regulieren. Dies gilt auch für die Untersuchung von zellulären Wirtsfaktoren, die für die Persistenz verschiedener Krankheitsmodelle erforderlich sind. In diesem Proteomik-Modell ist HIV-1 Rev IP für die B23-Interaktion optimiert, um Nukleolar-Faktoren aufzuklären, die an der nukleozytoplasmatischen Stilllegungsaktivität und HIV-1-mRNA-Bindung beteiligt sind. Darüber hinaus können Zelllinien entwickelt werden, die fest mit Infektionskrankheiten ausdrücken, die für wichtige Proteine von Interesse mangelhaft sind, ähnlich der HLfB-Zelllinie, um infektiöse Interessenspfade zu untersuchen.

Protocol

1. Zellkultur Bewahren Sie HLfB in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) auf, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat in gewebekulturbehandelten 100 mm Platten ergänzt wird. Halten Sie die Zellkulturen bei 37 °C in einembefeuchteten Inkubator, der mit 5% CO2 versorgt wird. Durchgang konfluente Zellen zu einer Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml. Verwerfen Sie die Zellkulturmedien. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml 1x Phosphat-…

Representative Results

Rev-NoLS Ein- und Mehrpunkt-Argininmutationen, die einer Vielzahl subzellulärer Lokalisierungsmuster entsprechen, wurden in ihrer Fähigkeit untersucht, mit zellulären Wirtsfaktoren im Vergleich zu WT Rev. WT Rev-3’flag und pcDNA-flag zu interagieren. Vektor wurden in der HLfB-Kultur ausgedrückt. Proteinkomplexe wurden aus dem gesamten Zelllysat verarbeitet und mit Silberfleckreagenz gebeizt. Rev-NoLS-3’flag ist in Abbildung 1(ca. 18 kDa) in drei verschiedenen Lysepufferbedingung…

Discussion

Massenspektrometrische Analysen, die Rev-NoLS-Mutationen und WT Rev in Gegenwart von HIV-1 verglichen, wurden bewertet, um Nukleolar-Faktoren zu verstehen, die am Virusreplikationszyklus beteiligt sind. Dadurch würden Nukleolar-Komponenten identifiziert, die für die virale Infektiosität erforderlich sind. Nucleolar B23 hat eine hohe Affinität zu Rev-NoLS und Funktionen in der Nukleolarlokalisation von Rev3 und nukleozytoplasmatischem Transport von Rev-gebundenen HIV mRNAs22</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen Dr. Barbara K. Felber und Dr. George N. Pavlakis für die HLfB-Anhängerkultur, die von den National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious zur Verfügung gestellt wird. Krankheiten (NIAID), NIH. Die Autoren würdigen auch Finanzquellen des NIH, Grants AI042552 und AI029329.

Materials

Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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