تحديد العوامل النيوكليولار أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال الترسيب المناعي القس والقياس الطيفي الكتلي
Summary
هنا نقوم بوصف الترسيب المناعي Rev في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لقياس الطيف الكتلي. ويمكن استخدام الأساليب الموصوفة لتحديد العوامل النووية التي تنطوي عليها الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1، وهي تنطبق على نماذج الأمراض الأخرى لتوصيف المسارات التي لم تدرس بعد.
Abstract
تتطلب الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تفاعلات البروتين الفيروسي مع العوامل المضيفة لتسهيل النسخ المتماثل الفيروسي، والتعبئة والتغليف، والإفراج. كما تتطلب الدورة المعدية تشكيل مجمعات بروتين فيروسية/مضيفة مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 RNA لتنظيم الربط وتمكين النقل النووي. ويحقق بروتين HIV-1 Rev التصدير النووي لـ HIV-1 mRNAs من خلال التعدد مع الأهداف التي تعمل برابطة الدول المستقلة– عنصر الاستجابة للمراجعة. توجد إشارة توطين نيوكليولار (NoLS) داخل فوهة الأذن العضوية للزخرفة الغنية بالارجين (ARM)، مما يسمح بتراكم مجمعات Rev/RRE في النواة. وتكهن تُتكهن العوامل النووية لدعم الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال وظائف أخرى مختلفة بالإضافة إلى التوسط في التصدير النووي المستقل عن الحمض النووي الريبي والربط. نحن نصف طريقة الترسيب المناعي من النوع البري (WT) Rev بالمقارنة مع الطفرات النووية Rev (الحذف والطفرات Rev-NoLS نقطة واحدة) في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لقياس الطيف الكتلي. العوامل النووية المتورطة في النقل النووي (Nucleophosmin B23 وNocleolin C23)، فضلا عن عوامل الربط الخلوية، تفقد التفاعل مع القس في وجود الطفرات Rev-NoLS. تم تحديد مختلف العوامل النووية الأخرى، مثل snoRNA C /D مربع 58، لتفقد التفاعل مع الطفرات Rev، ومع ذلك وظيفتها في دورة النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لا تزال غير معروفة. وتبين النتائج المعروضة هنا استخدام هذا النهج لتحديد العوامل النووية الفيروسية/المضيفة التي تحافظ على الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1. وتنطبق المفاهيم المستخدمة في هذا النهج على النماذج الفيروسية والأمراض الأخرى التي تتطلب توصيف المسارات التي لم تدرس بعد.
Introduction
وتفترض النوى كأرض التفاعل من مختلف المضيف الخلوي والعوامل الفيروسية اللازمة للنسخ المتماثل الفيروسي. النواة هي بنية معقدة مقسمة إلى ثلاث مقصورات مختلفة: مقصورة الفيبريلار، وحجرة الفيبريلر الكثيفة، والمقصورة الحبيبية. يُترجم بروتين HIV-1 Rev على وجه التحديد داخل المقصورات الحبيبية؛ ومع ذلك، السبب في هذا النمط الترجمة غير معروف. في وجود طفرات من نقطة واحدة ضمن تسلسل NoLS (Rev الطفرات 4 و 5 و 6)، يحتفظ Rev بنمط نيوكليولار وقد ثبت في السابق لإنقاذ تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2، ومع ذلك، مع انخفاض الكفاءة مقارنة WT Rev1 . جميع الطفرات نقطة واحدة غير قادرة على الحفاظ على دورة فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4-3 المعدية. في وجود طفرات متعددة من نقطة واحدة ضمن تسلسل NoLS (Rev-NoLS الطفرات 2 و 9)، وقد لوحظ Rev لتفريق في جميع أنحاء النواة والسيتوبلازم ولم يتمكن من إنقاذ فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2 النسخ المتماثل1. والهدف من هذه الدراسة البروتيوميات هو فك النيوكليولار وكذلك العوامل الخلوية nonnucleolar المشاركة في المسار المعدي فيروس نقص المناعة البشرية-1 بوساطة القس. يتم تحسين ظروف الترسيب المناعي القس من خلال التفاعل مع البروتين الفوسفاتي B23 النووي، الذي ثبت سابقا أن تفقد التفاعل مع القس في وجود الطفرات النووية.
وقد درست العوامل الخلوية Rev على نطاق واسع في الماضي; ومع ذلك، وقد تم ذلك في غياب مسببات الأمراض الفيروسية. بروتين واحد، على وجه الخصوص، التي تتميز في هذه الدراسة من خلال التفاعل القس خلال النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 هو البروتين الفوسفاتي النووي B23 – وتسمى أيضا نوكلوفوسمين (NPM)، نومترين، أو NO38 في البرمائيات2،3، 4.وأعرب عن B23 كما isoforms ثلاثة (NPM1، NPM2، و NPM3) – جميع أعضاء nucleophosmin / nucleoplasmin الأسرة النووية مرافقة5،6. وظائف المشاركات الجزيئية NPM1 في التجميع السليم للنيوكليوسومات، في تشكيل البروتين / مجمعات حمض نووي المشاركة في هياكل الكروماتين أعلى ترتيب7،8، وفي منع التجميع و طي البروتينات المستهدفة من خلال المجال الأساسي N-الطرفية (بقايا 1-120)9. وظائف NPM1 يمتد إلى التكوين الريبوسوم من خلال نقل الجسيمات preribosomal بين النواة والسيتوبلازم10،11، وتجهيز الحمض النووي الريبي preribosomal في تسلسل فاصل ة منقولة الداخلية 12،13، والقبض على تجميع النيوكليولار من البروتينات خلال الجمعية ريبوسومال14،15. وتورط NPM1 في تثبيط المبرمج16 وفي تثبيت مثبطي الورم ARF17و18 و P5319، وكشف عن دورها المزدوج كعامل oncogenic ومثبط الورم. NPM1 يشارك في الأنشطة الخلوية لاستقرار الجينوم، والنسخ المتماثل المركز، والنسخ. تم العثور على NPM1 في النوى أثناء دورة الخلية بين المراحل، على طول محيط الكروموسومات أثناء الالمتعدد، وفي الهيئات قبل النوكليار (PNB) في ختام الداء الميتومي. NPM2 و NPM3 ليست مدروسة جيدا كما NPM1، الذي يخضع لمستويات التعبير المتغيرة خلال الأورام الخبيثة20.
تم توثيق NPM1 في اغلاق النيوكليوسيتوبلازمية من مختلف البروتينات النووية / النووية من خلال NES الداخلية وNLS9،21 وكان قد ذكر سابقا لدفع الاستيراد النووي من البروتينات Tat وفيروس نقص المناعة البشرية وRev. في وجود B23 ملزمة المجال-β-galactosidase البروتينات الانصهار، تات يسيء توطين داخل السيتوبلازم ويفقد نشاط التنشيط. وهذا يدل على تقارب قوي من تات لB232. وأنشأت دراسة أخرى مجمعاً مستقراً للنسخة Rev/B23 في غياب التقييمات الإلكترونية المضادة للانبعاثات. في وجود RRE mRNA، ينفصل Rev عن B23 ويربط يفضل أن يكون فيروس نقص المناعة البشرية RRE، مما يؤدي إلى تشريد B2322. ومن غير المعروف أين، على المستوى دون النووي، يتم نقل تات وعملية تبادل Rev من B23 لفيروس نقص المناعة البشرية mRNA. يتم تفترض كل من البروتينات لدخول النوى في وقت واحد من خلال التفاعل B23. ومن المتوقع إشراك البروتينات الخلوية المضيفة الأخرى في مسار النيوكليولار لفيروس نقص المناعة البشرية. الأساليب الموصوفة في هذا التحقيق البروتيوميات سوف تساعد على توضيح التفاعل من النوى مع العوامل الخلوية المضيفة المعنية خلال مرض فيروس نقص المناعة البشرية-1.
وقد بدأ التحقيق في البروتيوميات من خلال التعبير عن الطفرات ذات النقطة الواحدة Rev NoLS (M4 و M5 و M6) وبدائل الأرجينين المتعددة (M2 و M9) لإنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2. في هذا النموذج، يتم نقل خط خلية HeLa التي تعبر بشكل ملحوظ عن نقص Rev HIV-1HXB2 (HLfB) مع الطفرات النيوكليولار WT Rev وRev التي تحتوي على علامة العلم في نهاية 3′. وسيؤدي وجود WT Rev إلى السماح بحدوث النسخ المتماثل الفيروسي في ثقافة HLfB، بالمقارنة مع طفرات Rev-NoLS التي لا تنقذ نقص Rev (M2 وM9)، أو تسمح بحدوث النسخ المتماثل الفيروسي ولكن ليس بكفاءة مثل WT Rev (M4 وM5 وM6)1. يتم جمع lysate الخلية 48 ح في وقت لاحق بعد الانتشار الفيروسي في وجود التعبير القس وتعرض لمناعة الترسيب مع العازلة lysis الأمثل للتفاعل Rev/B23. يتم وصف تحسين العازلة تحلل باستخدام تركيزات الملح متفاوتة، ويتم مقارنة أساليب الإلتبيلة البروتين لفيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev وتحليلها في الفضة الملطخة أو الكوماسي الملون SDS-PAGE هلام. وينطوي النهج البروتيومياتي الأول على التحليل المباشر لعينة من معدل WT Rev وM2 وM6 وM9 بواسطة قياس الطيف الكتلي جنباً إلى جنب. أما النهج الثاني الذي خضعت به الأيلات من WT Rev وM4 وM5 وM6 لعملية استخراج الجل إلى النهج الأول. يتم تحليل تقارب الببتيد إلى الطفرات Rev-NoLS بالمقارنة مع WT Rev وعرض احتمال تحديد البروتين. وتكشف هذه النُهُج عن العوامل المحتملة (النيوكليولار وغير النوكليولار) التي تشارك في نقل فيروس نقص المناعة البشرية-1 من الحمض النووي الريبي والربط مع Rev أثناء تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1. بشكل عام، فإن حالة الانحراف الخلوي، والملكية الفكرية، وelution الموصوفة تنطبق على البروتينات الفيروسية ذات الأهمية لفهم العوامل الخلوية المضيفة التي تنشط وتنظم المسارات المعدية. وهذا ينطبق أيضا على دراسة العوامل المضيفة الخلوية اللازمة لاستمرار نماذج المرض المختلفة. في هذا النموذج البروتيوميات، يتم تحسين فيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev IP للتفاعل B23 لتوضيح العوامل النووية المشاركة في نشاط اغلاق النيوكليوسيتوبلازمية وفيروس نقص المناعة البشرية-1 mRNA ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطوير خطوط الخلايا التي تعبر بشكل ملحوظ عن نماذج الأمراض المعدية التي تعاني من نقص في البروتينات الرئيسية ذات الأهمية، على غرار خط الخلايا HLfB، لدراسة مسارات الاهتمام المعدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تقييم التحليلات الطيفية الكتلية التي تقارن بين طفرات Rev-NoLS وWT Rev في وجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 لفهم العوامل النووية التي تنطوي عليها دورة النسخ المتماثل الفيروسي. وهذا من شأنه أن يحدد المكونات النووية اللازمة للعدوى الفيروسية. Nucleolar B23 لديه تقارب عالية إلى Rev-NoLS ووظائف في توطين الني?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وينوه المؤلفون بالدكتورة باربرا ك. فيلبر والدكتور جورج ن. بافلاكيس للثقافة الملتصقة بـ HLfB التي يوفرها برنامج المعاهد الوطنية للصحة للبحوث والكاشفات المرجعية، شعبة الإيدز، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية الأمراض (NIAID)، المعاهد القومية للصحة. ويعترف أصحاب البلاغ أيضاً بالمصادر المالية التي قدمتها المعاهد الوطنية للصحة، والمنح AI042552 وAI029329.
Materials
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-212 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Acrylamide:Bisacrylamide | BioRad | 1610158 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Chemical | A643-500 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| ANTI-Flag M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| BioMax MS film | Carestream | 8294985 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
| B23 mouse monoclonal IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carnation non-fat powdered milk | Nestle | N/A | |
| Cell scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
| C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
| Corning 100-mm TC-treated culture dishes | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
| 1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
| ECL Estern blotting substrate | Pierce | 32106 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Chemical | A409-4 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GelCode blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | |
| goat-anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2005 | |
| Iodoacetamide | ACROS Organics | 122270050 | |
| KimWipe delicate task wiper | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Scientific | 24600df | |
| 15-mL Polypropylene conical tube | Falcon | 352097 | |
| Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | |
| Purified BSA | New England Biolabs | B9001 | |
| PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| 10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
| TEMED | BioRad | 1610880edu | |
| Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
| Trizaic source | Waters | N/A | |
| trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CIS | |
| Tween 20 | BioRad | 1706531 | |
| Synapt G2 mass spectrometer | Waters | N/A | |
| Whatman filter paper | Tisch Scientific | 10427813 |
References
- Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
- Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
- Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
- Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
- Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
- Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
- Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
- Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
- Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
- Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
- Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
- Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
- Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
- Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
- Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
- Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
- Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
- Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
- Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
- Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
- Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
- Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
- Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
- Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
- Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
- Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
- Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
- Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
- Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
- Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
- Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
- Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
- Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).
