Summary

זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

Published: June 26, 2019
doi:

Summary

כאן אנו מתארים Rev immunoprecipitation בנוכחות של שכפול HIV-1 עבור ספקטרומטריה המסה. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות לזיהוי גורמי נוקלאוולאר המעורבים במחזור הזיהומיות של HIV-1, וחלים על מודלים אחרים של מחלות לאפיון מסלולים בעלי מחקר.

Abstract

מחזור הזיהומיות HIV-1 דורש אינטראקציות חלבון ויראליות עם גורמים מארחים כדי להקל על שכפול נגיפי, אריזה ושחרור. המחזור הזיהומיות מצריך היווצרות של מכלולי חלבון מארח ויראלי עם ה-HIV-1 RNA כדי לווסת את החבור ולאפשר הובלה באמצעות נוקלאוציטוטופלסמטי. ה-HIV-1 הפוך חלבון משיגה את היצוא הגרעיני של HIV-1 mRNAs באמצעות multimerization עם מטרות משחק של האחים הנוטרוניים-אלמנט התגובה Rev (בלבד). אות הלוקליזציה של נוקלאוולאר (NoLS) קיים בתוך COOH-הטרמינוס של הrev arginine עשיר מוטיב (זרוע), המאפשר הצטברות של מתחמי Rev/בעלי-מערכות בנוקלאוולוס. גורמי הנוקלאוולאר הם העריכו לתמוך מחזור זיהומיות HIV-1 באמצעות פונקציות אחרות שונות בנוסף ל-mRNA-עצמאי היצוא הגרעיני שחבור. אנו מתארים שיטה immunoprecipitation של פראי-סוג (WT) Rev בהשוואה מוטציות הפוך נוקלאוולאר (מחיקה ונקודה אחת Rev-NoLS מוטציות) בנוכחות של HIV-1 שכפול עבור ספקטרומטריה המסה. הגורמים הנוקלאופילים מעורבים בתחבורה הנוקלאוציטוטופלסמטי (נוקלאואופלסין B23 ונוקלאוולין C23), כמו גם גורמי שחבור סלולריים, לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות Rev-NoLS. גורמים שונים של נוקלאוולאר, כגון מ58, מזוהים לאבד אינטראקציה עם מוטציות Rev, אך תפקידם במחזור השכפול של HIV-1 נותרו לא ידועים. התוצאות המוצגות כאן להפגין את השימוש בגישה זו לזיהוי של נגיפי/מארח הגורמים הנוקלאוולמאר השומרים על מחזור זיהומיות HIV-1. המושגים המשמשים בגישה זו חלים על מודלים ויראליות ומחלות אחרים המחייבים אפיון של מסלולים בעלי מחקר חסר.

Introduction

הנוקלאוולוס שוכן כשטח האינטראקציה של מגוון מארח הסלולר והגורמים הנגיפים הדרושים לשכפול נגיפי. הנוקלאוולוס הוא מבנה מורכב החולק לשלושה תאים שונים: תא fibrillar, תא fibrillar צפוף, והתא הגרגירים. החלבון HIV-1 הפוך מכיל במיוחד בתוך תאים גרגירים; עם זאת, הסיבה לתבנית הלוקליזציה אינה ידועה. בנוכחות של מוטציות חד הנקודה בתוך רצף NoLS (מוטציות Rev 4, 5, ו 6), Rev שומר על דפוס נוקלאוולאר והוכח בעבר להציל HIV-1HXB2 שכפול, עם זאת, עם יעילות מופחתת לעומת WT Rev1 . כל המוטציות של נקודה אחת אינן מאפשרות לקיים את המחזור הזיהומיות של HIV-1NL4-3 . בנוכחות מוטציות מרובות נקודה אחת בתוך הרצף NoLS (מוטציות Rev-NoLS 2 ו -9), Rev כבר נצפתה להתפזר לאורך הגרעין הציטופלסמה ולא הצליח להציל HIV-1HXB2 שכפול1. המטרה של מחקר זה פרוטאומניקס היא לפענח נוקלאוולאר, כמו גם גורמים סלולריים nonnucleolar מעורב במסלול Rev-מתווך HIV-1 מדבקת. התנאים Rev immunoprecipitation ממוטבים באמצעות אינטראקציה עם נוקלאוולאר B23 פוספופפרוטאין, אשר בעבר הוכח לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות נוקלאוקולאר.

Rev הגורמים הסלולריים נחקרו בהרחבה בעבר; עם זאת, זה נעשה בהעדר פתוגנזה נגיפית. חלבון אחד, במיוחד, כי הוא מאופיין במחקר זה באמצעות הפוך אינטראקציה במהלך שכפול HIV-1 הוא נוקלאוולאר פוספהוופפרוטאין B23-נקרא גם נואופהוסמרין (npm), numatrin, או NO38 דו חיים2,3, 4. B23 מתבטא כשלוש איזוforms (NPM1, NPM2 וNPM3)-כל חברי המשפחה הגרעינית/נואופלמיסמין משפחת מלווה בנשק גרעיני5,6. המלווה המולקולרי NPM1 פונקציות בהרכבה נאותה של נוקלאוטיזומים, בהקמת מתחמי חומצות חלבון/גרעין המעורבים במבנים מסדר גבוה כרומטין7,8, ובמניעת צבירה ו קיפול חלבונים של יעד דרך מתחם ליבה N-terminal (שאריות 1-120)9. NPM1 פונקציונליות מרחיב הריבוכמה בראשית דרך התחבורה של חלקיקים preriboזומתיים בין הגרעין לציטופלסמה10,11, עיבוד של preriboזומא ברצף החלל הפנימי של מועתק 12,13, ומעצר את צבירת הנוקלאוולאר של חלבונים במהלך מכלול הריבוזומיום14,15. NPM1 הוא מעורב עיכוב של אפופטוזיס16 ו בייצוב של הגידול דכאי arf17,18 ו p5319, חשיפת תפקידה הכפול כגורם אונגניים ומדכא הגידול. NPM1 משתתפת בפעילות התאית של יציבות הגנום, שכפול הסנטרוכמה ותמלול. NPM1 נמצא נוקלאופולי במהלך המחזור הפנימי של מחזור התא, לאורך הפריפריה הרומוזומלית במהלך mitosis, ו ב prenucleolar גופים (PNB) בתום מיטוזיס. NPM2 ו NPM3 אינם למדו כמו NPM1, אשר עובר רמות ביטוי משתנה במהלך ממאירות20.

NPM1 מתועדת המעבר נוקלאוציטופטומיק של חלבונים גרעיניים/נוקלאוולאר שונים דרך נס פנימי ו-NLS9,21 בעבר דווחה לכונן את היבוא הגרעיני של HIV-1 תאת והפוך חלבונים. בנוכחות של B23-הדומיין-β-גלטוסידאז היתוך חלבונים, תאת מאחרבתוך הציטופלסמה ומאבדת פעילות הפעלה; זה מדגים אהדה חזקה של תאת עבור B232. מחקר נוסף הקים מתחם יציב Rev/B23 בהעדר של mRNAs המכיל את הקובץ. בנוכחות של בעל mRNA, Rev הנתק מ B23 ונקשר בעדיפות ל-HIV עם, המוביל לעקירה של B2322. זה לא ידוע איפה, ברמה הגרעינית תת, תאת ההפעלה ואת תהליך המרת Rev של B23 עבור HIV mRNA להתרחש. שני החלבונים מוצדדים להיכנס לנוקלאוולוס בו זמנית באמצעות B23 אינטראקציה. מעורבות של חלבונים סלולריים אחרים מארחים בנתיב הנוקלאוולאר של HIV צפוי. השיטות המתוארות בחקירה הפרוטסטנטית הזאת תסייע להבהיר את הגומלין של הנוקלאוולוס עם גורמים סלולאריים מארחים המעורבים במהלך הפתוגנזה HIV-1.

החקירה פרוטאומיקס הופעל באמצעות הביטוי של Rev nols מוטציות חד הנקודה (M4, M5, ו M6) והחלפות ארגינין מרובים (M2 ו-M9) עבור HIV-1HXB2 הייצור. במודל זה, קו של תא של הלה ביטוי באופן מופתי Rev-1HXB2 (hlfb) הוא מנוכר עם WT rev ומוטציות הפוך הכולל תג דגל בסוף 3 ‘. הנוכחות של WT Rev יאפשר שכפול ויראלי להתרחש בתרבות HLfB, בהשוואה מוטציות Rev-NoLS כי לא להציל מחסור Rev (M2 ו M9), או לאפשר שכפול נגיפי להתרחש אבל לא ביעילות כמו WT Rev (M4, M5, ו M6)1. ליפוסט התא נאסף 48 h מאוחר יותר לאחר התפשטות ויראלי בנוכחות Rev הבעה ונתון immunoprecipitation עם מאגר לפירוק ממוטב עבור האינטראקציה Rev/B23. מיטוב מאגר לליזה באמצעות ריכוזי מלח משתנה מתואר, ושיטות החלבון של HIV-1 Rev מושווים ונותחו בכסף מוכתם או Coomassie מוכתם SDS-דף ג ‘ לים. הגישה הראשונה פרוטקוממיקס כרוכה בניתוח ישיר של דגימת שלווה מבוטא WT הפוך, M2, M6, ו M9 על-ידי טנדם ספקטרומטר מסה. הגישה השנייה שבה האלוטים של WT Rev, M4, M5, ו M6 עברו תהליך החילוץ ג’ל הוא לעומת הגישה הראשונה. פפטיד זיקה כדי Rev-NoLS מוטציות בהשוואה WT Rev מנותח ואת ההסתברות זיהוי חלבון מוצג. גישות אלה חושפים גורמים פוטנציאליים (נוקלאוקולאר ו-nonnucleolar) המשתתפים בתחבורה HIV-1 mRNA ושחבור עם Rev במהלך שכפול HIV-1. באופן כללי, פירוק התא, IP, ותנאי הימנעות מתוארים חלים על חלבונים ויראלי של עניין להבנת גורמים סלולריים מארחים המפעילים ומווסת מסלולים זיהומיות. הדבר חל גם על חקר גורמי מארח סלולריים הנדרשים להתמדה של דגמי מחלות שונות. במודל זה פרוטאומניקס, HIV-1 Rev IP ממוטב עבור B23 אינטראקציה כדי להבהיר גורמים נוקלאואוליאר מעורב בפעילות שיוט נוקלאוצילסמטי ו-HIV-1 mRNA מחייב. בנוסף, קווי התא המבטא באופן בלתי נשכח דגמי מחלות זיהומיות כי הם חסרים חלבונים מפתח של עניין ניתן לפתח, בדומה לקו התאים HLfB, כדי ללמוד מסלולים זיהומיות של עניין.

Protocol

1. תרבית תאים לשמור HLfB ב בינונית שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS), 2 מ”מ L-גלוטמין, ו 1 mM נתרן פירובט בתוך רקמות-תרבות מטופלים 100 מ”מ לוחות. לשמור על תרביות תאים ב 37 ° c בתוך מחולל לחות שסופקו עם 5% CO2. המעבר מקשר תאים לצפיפות תאים של 1 x 106 תאים/mL. מחק את מד?…

Representative Results

Rev-nols יחיד ומספר נקודות מוטציות ארגינין, המתאים למגוון דפוסי לוקליזציה subcellular, נבדקו ביכולתם לתקשר עם גורמים מארחים סלולריים לעומת wt rev. wt rev-3דגל pcdna-דגל וקטור הביעו ביטוי בתרבות HLfB. מכלולי חלבון עובדו מפני התאים האולטימטיביים ומוכתמים בצבע כסף מגיב. Rev-NoLS-3דגל הוא לזיהוי (כ 18 kDa) בשלושה תנ…

Discussion

מנתח ספקטרומטר המסה השוואת מוטציות Rev-NoLS ו-WT Rev בנוכחות HIV-1 העריכו להבין גורמים נוקלאוולאר מעורב מחזור שכפול נגיפי. זה יזהה את רכיבי הנוקלאוולאר הדרושים לנגועים בנגיף. הנוקלאוולאר B23 יש זיקה גבוהה Rev-NoLS ופונקציות בלוקליזציה נוקלאואוליאר של Rev3 והובלה נוקלאוציטוטופלסמטי של מאוג…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים את ד ר ברברה ק. פלבר וד ר ג’ורג ‘ נ. פאוולקיס עבור התרבות החסיד של ה-HLfB שמספקת המכון הלאומי לבריאות (NIH) מחקר והתייחסות תוכנית מגיב, חטיבת האיידס, המכון הלאומי לאלרגיה וזיהומיות מחלות (NIAID), NIH. המחברים מכירים גם במקורות פיננסיים המסופקים על ידי NIH, מענקים AI042552 ו-AI029329.

Materials

Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Play Video

Cite This Article
Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

View Video