Bu iletişim kuralı açıklar tek zinciri MHC sınıf ı insan CD8 + T hücre aktivasyonu moleküler etkileşimlerde araştırmaya kompleksleri: mühendislik antijen sunan tek zincir ifade hücreleri nesil oluşturur, kültür insan CD8 + T hücre klonu ve T hücre aktivasyonu deneyler.
Sigara uyarıcı kendini peptid MHC (pMHC) kompleksleri T hücre aktivasyonu ve efektör fonksiyonları teşvik değil ama agonist pMHC, co-agonism olarak adlandırılan bir süreç için T hücre yanıt geliştirebilirsiniz. Bu iletişim kuralı bir deneysel açıklar insan MHC ifade ederek insan CD8 + T hücre aktivasyonu sırasında co-agonism araştırmak için sistem sınıf ı molekülleri önceden belirlenmiş peptidler olarak sunan tek polipeptitler (tek zincir MHC) bir xenogeneic hücre satırı. Tek zincir MHCs nerede agonist tek zincir p-MHC kompleksi seviyesinin düşük ve yüksek düzeyde uyarıcı olmayan tek zincir p-MHC kompleksi ifade edildi koşullar altında dile getirdi. Bu deneysel sistemini uyarıcı pMHC içinde CD8 + T hücre yanıt-e doğru agonist pMHC karşılaştırmak izin verdi. Hücre satırı transfection protokolünü açıklar tek zincir MHC yapıları, nesil istikrarlı hücre hatları, kültür Hepatit B virüs özgü insan CD8 + T hücreleri ve T hücre aktivasyonu deneyler aynı anda sayısal sitokin üretim ve degranulation. Sunulan yöntemleri CD8 + T hücre aktivasyonu, farklı özellikleriyle ilgili araştırma insan T hücre sistemlerinde bilinen peptid MHC özgüllük ile kullanılabilir.
MHC sınıf ı (MHC-ben) molekülleri kısa (8-10 amino asitler) peptidler her hücre tarafından sentezlenen protein elde mevcut. MHC-ben molekülleri sağlıklı hücreleri üzerinde mevcut öz peptidler endojen proteinler türetilmiş. Viral enfeksiyon yol olmayan kendine virüs kaynaklı peptidler sunuya üzerinde MHC- ama bile enfekte hücreleri mevcut olmayan kendine peptidler kendini peptid-MHC (pMHC) büyük miktarda huzurunda. MHC-T hücre reseptör (TCR) ve CD8 co reseptör T hücreleri tarafından tanınır. CD8 bağlama peptid bağımsız ise TCR bağlama benzeşme peptid pMHC için sunulan peptidler, dizi son derece bağlıdır. Olmayan kendine agonist pMHC karmaşık TCR bağlama T hücre aktivasyonu ve efektör fonksiyonları için yol açar. Sigara uyarıcı kendini pMHC kompleksleri T hücre aktivasyonu ve efektör fonksiyonları teşvik değil ama agonist pMHC, co-agonism1,2,3olarak adlandırılan bir süreç için T hücre yanıt geliştirebilirsiniz. Co-agonism fare CD4 + T hücreleri4,5,6 yanı sıra fare ve insan CD8 + T hücreleri7,8,9,10, gözlenen 11 , 12 , 13. fizyolojik koşullar altında T hücreleri üzerinde uyarıcı pMHC kompleksleri, o co-agonism katkıda bulunduğu için en uygun T düşündüren yüksek düzeyde işbirliği sunan hücreler (ZPT) sunulması antijen agonist pMHC sınırlı miktarlarda tanımak gerekir hücre yanıt içinde vivo. Toplam hücre yüzey MHC sınıf ı düzeyleri sık sık viral enfeksiyonlar14 sırasında ve tümör15downregulated bulunmaktadır. Bu bağışıklık kaçırma strateji agonist pMHC sunu azaltır, ancak aynı zamanda co agonist pMHC miktarını azaltır ben T hücre harekete geçirmek geliştirme için kullanılabilir. Ayrıca, yüksek hücre yüzey ifade düzeyleri MHC sınıf ı molekül HLA-C ilişkilendirmek için toplam MHC sınıf için kritik bir rol öne geliştirilmiş HIV kontrolü ile16, ben T hücre aktivasyonu ifadede gösterilmiştir. Co-agonism fizyolojik öneme rağmen onun moleküler mekanizma hala eksik olarak anlaşılmaktadır. Bu deneysel agonist pMHC sabit tutarken sunulan co agonist pMHC denetlenmesini büyük ölçüde teknik zorlukları kaynaklanmaktadır.
Bir deneysel geliştirdiğimiz sistem insan MHC ifade ederek insan CD8 + T hücre aktivasyonu sırasında co-agonism araştırmak için sınıf ı molekülleri tek polipeptid olarak önceden belirlenmiş peptid sunulması (tek zincir MHC-ben şekil 1A) xenogeneic hücrede 9,10satır. Tek zincir (sc) agonist pMHC hamster kaynaklı T-REx CHO hücre satırında tetrasiklin önleyici ifade tetrasiklin-indüklenebilir organizatörü kontrolü altında ifade edildi; Bu yokluğunda tetrasiklin ve yüksek sc agonist pMHC ifade sonra tetrasiklin (şekil 1BC) eklenmesi, sc agonist pMHC çok düşük “sızan” ifade sağlar. Sc agonist pMHC ifade T-REx CHO hücreleri sonra sigara-uyarıcı, co agonist sc pMHC ile supertransfected vardı-ben bir yapısal etkin organizatörü (şekil 1BC) kontrolü altında. Bu deneysel sistemini uyarıcı pMHC yüksek düzeyde ve CD8 + T hücre yanıt-e doğru agonist pMHC karşılaştırmak izin verdi. Eleştirel, beri peptid ve MHC-ben ağır zincir kovalent bağlı scMHC-ben format, bu önceden belirlenmiş peptidler sunumu MHC molekülleri içine mutasyonların tanıtımları sağlar. ScMHC kullanımı-Ben teknoloji böylece bize özellikle agonist veya eş agonist pMHC TCR ve CD8-bağlama özelliklerini modüle izin.
Co-agonism CD8 + T hücre aktivasyonu içinde gözlenen arıtılmış MHC kullanarak-ben agonist ve co agonist peptidler heterodimers11,şeklinde sunulması kompleksleri17 veya üzerinde sunulan kuantum nokta12,13. Co-agonism CD8 + T hücre aktivasyonu agonist pMHC tanıma APC Tarih içinde belgili tanımlık bağlam içinde erken çalışma TAP2-eksik hücre hatları ZPT kullanılır. DOKUNUN peptid taşıyıcısından sitoplazma endoplazmik retikulum için gereklidir ve DOKUNUN-eksikliği ciddi kullanılabilir MHC sınıf ı-bağlama peptidler havuzu azaltır. Peptidler yokluğunda, doğmakta olan tesisin MHC sınıf ı ağır zincir ve β2– Mikroglobulin kararsız, çok düşük MHC sonuçlanan-yüzey ifade hücre. Başlangıçta, karşılaştırma DOKUNUN yeterli ve – eksik fare RMA ve RMA-S hücre hatları, antijen ile uyarılan T hücrelerinin anılan sıraya göre ZPT, co-agonism için herhangi bir delil sırasında fare T hücre harekete geçirmek18olmadığını göstermiştir. Ancak, bu deneysel sistemini uyarıcı öz pMHC bağımsız olarak sunulan agonist pMHC miktarı üzerinde tam denetim izin vermedi. Ayrıca, bu iki hücre satırları ayrıca ligandlar T hücre co-stimulatory veya inhibitör reseptörleri gibi T hücre aktivasyonu modüle diğer molekülleri veya adezyon molekülleri ifade farklı olabilir.
Daha sonra biz sabit bir miktar olan agonist pMHC sunumu uyarıcı pMHC içinde izin vermek için eksojen peptidler hücrelerle TAP2-eksik RMA-S yükleme için bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. Bu aracılığıyla aşağıdaki sağlanır: kuluçka TAP2-eksik RMA-s hücreleri boş MHC dengelemek için daha düşük sıcaklıklarda (28 ° C, yerine her zamanki 37 ° C) sınıf ı ağır zinciri/β2 Mikroglobulin kompleksleri19; Kuluçka eksojen agonist peptid ile 28 ° c; Kuluçka eksojen uyarıcı peptid olup içinde 28 ° c; ve kuluçka 37 ° C’de boş MHC hücre yüzey ifade azaltmak için sınıf ı kompleksleri8,9. Bu deneysel kurulum kullanımı olmayan uyarıcı pMHC varlığı fare timositleri, saf periferik CD8 + T hücreleri ve CTL8harekete geçirmek gelişmiş saptandı. Mechanistically, uyarıcı pMHC varlığı yokluğunda bile T hücre: APC bağışıklık synapse için CD8 alımı agonist pMHC tetikleyebilir ve uyarıcı pMHC TCR etkileşim CD8 coreceptor7,8ile geliştirebilirsiniz. Ancak, bu deneysel sistem harekete geçirmek geliştirme MHC sınıf ı-cekti TCR veya CD8 bağlama değiştiren herhangi bir değişiklik olarak arabuluculuk agonist ve co agonist pMHC TCR ve CD8 coreceptor bağlamaya göreli katkılarıyla test izin vermez sunulan peptid ne olursa olsun tüm MHC molekülleri etkiler. Biz bu nedenle bu sorunun üstesinden gelmek için zinciri teknoloji tek MHC sınıf kullanılır.
Ben format tek zincir (sc) MHC sınıf daha önce antijenik pMHC tanıtımı için tedavi stratejileri geliştirmek ve TCR ve NK hücre reseptör etkinleştirme mekanizmaları temel sorulara cevap ve20,21 işlev kullanılmış . scMHC-peptit, β2– Mikroglobulin ve MHC oluşur-ben ağır zincir, iki esnek serin/glisin-zengin vurgulamaktadır (şekil 1A) tarafından katıldı birkaç farklı Bağlayıcı sıraları edilmiştir geliştirilmiş ve test22. scMHC-ben kat karmaşık DOKUNUN bağımsız olarak ve refakat geleneksel pMHC karmaşık derleme20için gerekli proteinler. scMHC-doğru22 boyama conformation özgü antikor kullanılarak belirlenen ve x-ışını kristalografisi23yapısıyla sc çözme tarafından katlayın göstermiştir. Temel scMHC-ben tasarım bağlama düşük benzeşme peptidler24,25artırmak için modifiye edilmiştir.
Bu iletişim kuralı insan scMHC açıklar-ben co-agonism sırasında insan CTL araştırmak için klon harekete geçirmek. Protokol insan CTL klon Hepatit B virüsü (HBV) bir epitope için belirli için optimize edilmiştir. HBV ve kronik HBV enfeksiyonu ile enfekte 350 milyon kişi Hepatosellüler karsinom (HCC) gelişmesine neden olabilir olarak orada HBV bir ciddi sağlık dünya çapında, yüktür. HBV enfeksiyonu sonucu HCC hücreleri genellikle HBV kaynaklı epitopları sunabilir ve belirli insan T hücreleri tarafından kabul edilebilir. HBV ve HCC izni insan T hücre yanıt-e doğru26tarihinde dayanır ama HCC hastalar genellikle T hücre bitkinlik ve azaltılmış T hücre yanıt-e doğru27muzdarip. HBV özgü TCR giriş HBV T hücrelerinin içine kronik HBV enfeksiyonu28ortadan kaldırmak için bir potansiyel immünoterapi strateji olarak çalıştı. Ancak, o bilinmeyen ise bu yöntem yüzey MHC düşük düzeyde bir klinik ortamda etkili olacak-ben insan tetkikine29. Bu nedenle, coagonism mekanizması anlama alternatif bakış açıları HBV, immünoterapi için muhtemelen T hücre co-agonism-aracılı yanıt-e doğru uyarmak için endojen pMHC sunumunu güçlendirerek sağlayabilir. Araştırma için tüm gerekli adımları insan co-agonism tarihinde protokol kapsar: transfection T-REx CHO hücre agonist ve co agonist sc pMHC, istikrarlı T-REx CHO hücre hatları üretimi, kültür HBV özgü insan CTL CD8 + T hücre kültürünü ve CTL etkinleştirme sitokin üretim ve degranulation yanıt olarak T-REx CHO hücrelerin miktarının deneyler. Her ne kadar biz sc MHC kullanarak odak sınıf ı co-agonism HBV T hücre aktivasyonu sırasında araştırmak için teknoloji, sunulan yöntemleri kolayca insan T hücre sistemleri ile bilinen pMHC T hücre aktivasyonu diğer yönleri üzerinde araştırma için adapte edilebilir olduğunu belirtmek gerekir-Ben özgüllüğü.
Bu iletişim kuralı bir insan CD8 + CTL satırı özel HBV kaynaklı peptid E183-91 için kullanır (FLLTRILTI: “E183”) HLA-A2 üzerinde sunulan30 . sc HLA molekülleri, insan B2-Mikroglobulin sinyal serisinden oluşan HLA-A2 bağlama peptid ilgi, glisin/serin bağlayıcı, bir insan B2-Mikroglobulin, glisin/serin bağlayıcı ve ağır zincir ticari olabilir bir A2 (şekil 1A sentezledim. ). ScA2 yapıları agonist E183 peptid veya coagonist HIV GAG (SLYNTVATL)31 peptidler kodlama plazmid yazarlardan istek üzerine mevcuttur. Peptid sıra yönetmen sitesi-mutagenesis kullanılarak değiştirilebilir. Tetrasiklin-indüklenebilir vektör pcDNA5/kime E183 peptid (sc E183-HLA-A2) ile agonist tek zincir HLA-A2 ifade etmek için kullanılmıştır. Tetrasiklin önleyici, pcDNA5 huzurunda/plazmid için sadece çok düşük, “sızan” ifade ilgi protein sağlar; yüksek ifade tetrasiklin (şekil 1BC) eklenmesi tarafından indüklenen. Tetrasiklin-indüklenebilir ifade sistemini hücre yüzey agonist pMHC ifade miktarı üzerinde kontrol sağlar. Bir bünye ifade plazmid pcDNA3.1 coagonist scA2 GAG peptid (sc GAG-HLA-A2) ile ifade etmek için kullanılmıştır. Tetrasiklin düzenlenir ifade (T-REx) CHO hücre satırı (hamster hücre satırı, endojen hiçbir insan MHC) agonist ve co agonist sc-HLA-A2 yapıları ifade etmek için kullanılmıştır. Bu deneysel sistem pMHC sunum (şekil 1 c) üzerinde tam denetim sağlar: yok pMHC Tanıtım (untransfected T-REx), ortak agonist pMHC sunum (kurucu sc GAG-HLA-A2 ifade) yüksek miktarda, agonist pMHC düşük miktarda Tanıtım (sc E183-HLA-A2 yokluğunda tetrasiklin,), agonist pMHC sunum (sc E183-HLA-A2 tetrasiklin varlığında) yüksek miktarda, agonist pMHC tanıtımı ve yüksek ifade ortak agonist pMHC düşük miktarda (sc E183-HLA-A2 Devamsızlık tetrasiklin ve kurucu sc GAG-HLA-A2 ifade). Bu deneysel sistem kullanımı agonist ve coagonist pMHC hücre yüzey miktarda hassas kontrol sağlar.
Sunulan Protokolü moleküler etkileşimleri soruşturma sırasında insan CD8 + T hücre aktivasyonu için güçlü bir araç sağlar. Co-agonism soruşturma sırasında insan T hücre aktivasyonu için önemli bir adım agonist pMHC sunu veya eş agonist pMHC ifade olmadan ZPT üzerinde eşit agonist sağlamak için hücre yüzey ifade pMHC üzerinde kontrol var. Deneysel sistemimizde bu bir tek hücre klon agonist pMHC supertransfection tarafından TCR benzeri antikor10, kullanarak bir ortak agonist pMHC yapý ve agonist pMHC miktar ile takip, düşük miktarda ifade kullanarak elde edilir 32. agonist sc pMHC ifade zamanla değişebilir, o agonist pMHC yüzey ifade TCR benzeri antikorları kullanarak her deneyde kullanılan ZPT üzerinde ölçmek için önemlidir. Hiçbir spesifik TCR benzeri antikor kullanılabilirse, agonist scMHC-floresan protein füzyon olarak ifade edilebilir ve hücre yüzey ifadesini sonra toplam iç yansıma Floresans mikroskobu gibi bir hassas mikroskopi yöntemi kullanarak sayısal 35 , 36. Ayrıca, ortak agonist pMHC hücre yüzey ifade metilasyonu bağlı ve – bağımsız CMV organizatörü37, susturmak nedeniyle, zaman içinde azalır ve ile antikor boyama ve Akış Sitometresi Analizi, kullanarak takip edilmelidir tekrarlanan FACS-gerektiğinde sıralama. Biz 5 hafta sc pMHC ifade nispeten sınırlı kaybı için CHO hücreler kültürlü. Biz çok kısa bir süre sonra seçimi/hücre bilinen sc MHC ifade ile güvenilir bir hisse senedi sağlamak için sıralama CHO hücreleri dondurma öneririz.
Ekipman durumu bağlı olarak veya özel araştırma amaçları bağlı olarak sunulan iletişim kurallarının birkaç adım değiştirilebilir. Örneğin, PBMC nükleer silahların yayılmasına karşı potansiyel olmak Inhibe (Adım 3.2.1) kullanarak bir gama (X-) değil istemek ya da alternatif yöntemler irradiator, mitomycin C38ile tedavi gibi. 3.3.1. adımda kazıma hücre yerine metal şelatörlerin39 içeren bir enzimatik olmayan hücre ayrılma arabellekleri kullanılabilir. Ayrıca, sistem sunulması antijen için insan CTL klonlar ifade farklı TCRs. CHO hücreleri hızlı hamster MHC sınıf ı molekülleri ve burada okudu CTL satırı için alakasız olmakla birlikte bunlar daha uygun yapmak için değiştirilebilir (şekil 2A ve Şekil 3A, biz gözlenen untransfected CHO hücreler hiçbir T hücre yanıt), diğer insan TCRs bazı xenoreactivity gösterebilir bir olasılık. Buna durumda, hamster MHC ifade sınıf hamster B2-microglubulin knocking tarafından azaltılabilir veya CRISPR/Cas9 kullanarak DOKUNUN; veya CRISPR/Cas9-aracılı B2-microglubulin veya DOKUNUN nakavt sonra insan bir APC satırı kullanılabilir.
Burada sunulan deneysel sistem önceden tanımlanmış peptidler sunumu MHC molekülleri ile TCR ve CD8 etkileşimlerin hassas kontrol sağlar. Örneğin, biz daha önce CD8 bağlama40 coagonist pMHC kaldırılması mutasyonlar fare ve insan CD8 + T hücreleri9,10, coagonist-aracılı harekete geçirmek donanım ortadan TCR abrogating ise göstermiştir Co agonist pMHC ile etkileşimi harekete geçirmek coagonist-aracılı geliştirme10üzerinde bir etkisi vardı. Ancak, tek zincir MHC yapıları kullanımı bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, bu zaman ve bu birden fazla plazmid sc MHC farklı peptidler ve sonraki transfections ve hücre sıralama ile kodlama nesil içerir gibi birden çok eş agonist peptid sınamak için emek tüketen bu deneysel sistem kullanarak dizileri. Daha önce biz fare DOKUNUN-eksik hücre kültürünü RMA-S birden çok eş agonist peptidler fare T hücre harekete geçirmek8,9sınamak için kullanılan, ancak bu yaklaşım DOKUNUN-eksik insan T2 hücre satırı10ile büyük olasılıkla başarısız oldu DOKUNUN bağımsız peptidler41tanıtımı nedeniyle. Başka bir kısıtlamadır deneysel sistemimizin bu ortak agonist pMHC T hücre aktivasyonu tetiklemek için gerekli kritik miktarı belirlenmesi amacıyla ortak agonist pMHC molekülleri miktarını değiştirme için hızlı bir yöntem sağlamaz. Değişen tetrasiklin konsantrasyon HLA-A2 pozitif hücrelerinin oranını değiştirir gibi Ayrıca, kullanılan tetrasiklin-indüklenebilir sistemi titrasyon agonist pMHC miktar tek hücre düzeyinde tetrasiklin konsantrasyon değiştirerek izin vermez, Hücre başına olarak HLA-A2 düzeyleri yerine. Şu anda araştırıyoruz alternatif bir yaklaşım co-agonism fare CD4 + T hücre harekete geçirmek4 sırasında araştırmak için daha önce kullanılan desteklenen lipid bilayers42, kullanmak veya sunan sabit tutar olan agonist pMHC boncuk Co agonist pMHC değişen miktarlarda varlığı. UV yarilabilir peptid teknoloji4,43ile birlikte kullanıldığında, bu alternatif deneysel sistemleri hızlı birden çok eş agonist peptid dizileri yanı sıra eş agonist pMHC farklı miktarda test izin vermelidir .
Tek zincir MHC sınıf II moleküller sunulması peptidler başarıyla memeli hücre yüzeyleri44ifade edilmiştir önceden belirlendiği gibi sc MHC teknoloji aynı zamanda co-agonism CD4 T hücrelerinde, insan veya fare incelenmesi için geçerli olabilir. Ayrıca, sc MHC teknoloji kullanımı gibi HLA-E. klasik olmayan MHC molekülleri incelenmesi için Genişletilebilir SC HLA-E daha önce açıklanan ve onun ifade insan T hücre harekete geçirmek45inhibe olduğu gösterilmiştir. Başka bir klasik olmayan MHC ilgi lipidler peptidler46yerine sunar CD1 moleküldür. Sc yapıları CD1 ağır zincir ve B2-Mikroglobulin oluşan hücre yüzeyinde ifade edilecek ve ilgili lipid ligandlar47bağlamak için gösterilmiştir. Tek zincir MHC teknoloji moleküler etkileşimleri T ve NK hücre aktivasyonu sırasında araştıran bir araştırma aracı olarak büyük bir potansiyele sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Singapur Sağlık Bakanlığı’nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi altında oluştur altında R571-002-012-592 için Pam., Ulusal Araştırma Vakfı Investigatorship R571-000-272-281 Pam için tarafından N.R.J.G. için onun CBRG/0064/2014 tarafından desteklenmiştir . ve AB için bir Singapur translasyonel araştırma (STaR) Araştırmacı Ödülü (NMRC/STaR/013/2012) tarafından Uzman hücre sıralamak için NUS İmmünoloji program akışı çekirdek tesisten Dr Paul Hutchinson ve Bay Teo Guo Hui için minnettarız. Elijah Chen için el yazması eleştirel okuma için minnettarız.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |