ويصف هذا البروتوكول الاستخدام سلسلة واحدة MHC الفئة الأولى مجمعات للتحقيق في التفاعلات الجزيئية في تنشيط الخلية CD8 + “تي” البشرية: يبني جيل مستضد هندسيا عرض الخلايا معربا عن سلسلة واحدة، ثقافة البشرية استنساخ الخلية CD8 + T وتجارب التنشيط خلية تي.
الببتيد النفس عدم تنشيطية مجمعات MHC (الرهن العقاري) الحث على عدم مهام التنشيط والمستجيب خلية T، ولكن يمكن تعزيز استجابات الخلية T للرهن العقاري مؤثر، من خلال عملية تسمى أجونيسم co. يصف هذا البروتوكول التجريبي نظام التحقيق co-أجونيسم أثناء تنشيط الخلية CD8 + “تي” البشرية بالتعبير عن MHC البشرية الفئة الأولى تقديم الببتيدات سلفا كجزيئات مفردة البروتينية (واحد في سلسلة MHC) في خط خلية إكسينوجينيك. وأعربنا عن سلسلة واحدة مكس تحت ظروف حيث أعرب عن المستويات المنخفضة لمؤثر واحد في سلسلة MHC ف المجمعات ومستويات عالية من مجمعات MHC ف سلسلة واحدة غير محفزة. استخدام هذا النظام التجريبي سمح لنا بمقارنة CD8 + تي خلية الردود على الرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري غير محفزة. وصف البروتوكول تعداء خط الخلية مع ثوابت السلسلة واحدة MHC، خطوط جيل خلية مستقرة، الثقافة الخاصة بفيروس التهاب الكبد البائي البشرية CD8 + “تي” الخلايا وتنشيط خلية T تجارب إنتاج سيتوكين في الوقت نفسه تحديد و تحبب. يمكن استخدام طرق عرض للبحوث المتعلقة بجوانب مختلفة من CD8 + تي خلية التنشيط في النظم البشرية T الخلية مع خصوصية الببتيد المعروفة MHC.
MHC الفئة الأولى (MHC–أنا) تقديم جزيئات الببتيدات قصيرة (8-10 الأحماض الأمينية) المستمدة من البروتينات تصنيعه من كل خلية. MHC–أنا الجزيئات في خلايا صحية تقدم النفس الببتيدات المستمدة من البروتينات الذاتية. التهاب فيروسي يؤدي إلى العرض تقديمي الببتيدات المشتقة من الفيروسات غير المتمتعة بالحكم الذاتي على MHC–أنا، ولكن الخلايا المصابة حتى هذه الببتيدات غير المتمتعة بالحكم الذاتي وجود كميات كبيرة من النفس الببتيد-MHC (الرهن العقاري). MHC-هو يقرها مستقبلات خلية تي (تكر) ومستقبلات CD8 المشارك في خلايا تي. تكر تقارب ملزمة للرهن العقاري الببتيد يعتمد اعتماداً كبيرا على تسلسل الببتيدات المقدمة، حين ملزمة CD8 الببتيد المستقلة. تكر ملزمة للرهن مؤثر غير المتمتعة بالحكم الذاتي مجمع يؤدي إلى وظائف الخلية تي التنشيط والمستجيب. المجمعات الرهن الذاتي تنشيطية عدم الحث على عدم مهام التنشيط والمستجيب خلية T، ولكن يمكن تعزيز استجابات الخلية T للرهن العقاري مؤثر، من خلال عملية تسمى شركة أجونيسم1،،من23. وقد لوحظ أجونيسم Co في الماوس CD4 + “تي” الخلايا4،،من56 فضلا عن الماوس والبشرية CD8 + “تي” الخلايا7،،من89،10، 11 , 12 , 13-تحت الظروف الفسيولوجية، خلايا تي بحاجة إلى الاعتراف بكميات محدودة للرهن العقاري مؤثر على مستضد تقديم الخلايا (Apc) شارك تقديم مستويات عالية من مجمعات الرهن غير محفزة، اقتراح يسهم ذلك co-أجونيسم تي الأمثل الخلية الحية في الردود. خلية الإجمالي سطح الطبقة MHC أنا المستويات كثيرا ما دوونريجولاتيد خلال14 من الالتهابات الفيروسية والأورام15. هذه الاستراتيجية محصنة ضد التهرب من إنقاص عرض الرهن العقاري مؤثر، ولكن أيضا يقلل من مقدار الرهن مؤثر المشارك أنا متاحة لتعزيز تنشيط خلية تي. وعلاوة على ذلك، الفئة الأولى خلية ارتفاع مستويات التعبير السطحي MHC جزيء ج هلا قد ثبت أن ترتبط مع تحسين فيروس نقص المناعة البشرية مراقبة16، مما يوحي دور حاسم لمجموع MHC class التعبير في تنشيط خلية تي. وعلى الرغم من أهمية فسيولوجية co-أجونيسم، لا يزال غير كامل المفهوم آليتها الجزيئية. هذا إلى حد كبير بسبب التحديات التقنية تجريبيا مراقبة مقدار الرهن مؤثر المشارك قدم مع إبقاء مؤثر ثابت الرهن العقاري.
قمنا بتطوير تجريبي نظام التحقيق co-أجونيسم أثناء تنشيط الخلية CD8 + “تي” البشرية بالتعبير عن MHC البشرية الفئة الأولى جزيئات تقديم الببتيد سلفا ببتيد واحد (واحد سلسلة MHC-الأول، الشكل 1A) في خلية إكسينوجينيك خط9،10. وأعرب الرهن مؤثر واحد في سلسلة (sc) تحت سيطرة المروج التتراسيكلين إيندوسيبلي في خط الخلية تشو تي ركس المستمدة من الهامستر الإعراب عن التتراسكلين قامع؛ يسمح هذا التعبير “راشح” منخفضة جداً لاتفاقية استكهولم مؤثر الرهن العقاري في غياب التتراسيكلين واتفاقية استكهولم ارتفاع مؤثر الرهن التعبير بعد إضافة التتراسيكلين (الشكل 1، ج). وكانت الزنزانات تشو تي ركس sc مؤثر معربا عن الرهن العقاري ثم سوبيرترانسفيكتيد مع مؤثر المشارك غير محفزة، اتفاقية استكهولم الرهن-الأول تحت سيطرة أحد المروجين مؤثرا النشطة (الشكل 1، ج). استخدام هذا النظام التجريبي سمح لنا بمقارنة CD8 + تي خلية الردود على الرهن العقاري مؤثر في وجود أو عدم وجود مستويات عالية للرهن العقاري غير محفزة. حاسمة، منذ الببتيد و MHC-أنا سلسلة ثقيلة ترتبط تساهميا في سكمهك-أنا تنسيق، وهذا يسمح مقدمات للطفرات إلى جزيئات MHC عرض الببتيدات سلفا. استخدام سمك–أنا التكنولوجيا مما أتاح لنا أن تعدل خصائص تكر أو CD8-ملزم للرهن العقاري مؤثر أو مؤثر المشارك على وجه التحديد.
Co-أجونيسم في تنشيط الخلية CD8 + T وقد لوحظ استخدام MHC المنقي-أنا مجمعات عرض مؤثر ومؤثر المشارك الببتيدات في شكل هيتيروديميرس11،17 أو عرضها على الكم ونقاط12،13. العمل في وقت مبكر في co-أجونيسم في تنشيط الخلية CD8 + “تي” في السياق الاعتراف بالرهن العقاري مؤثر في آسيا والمحيط الهادئ كخطوط الخلايا التي تفتقر إلى TAP2 ناقلات الجنود المدرعة. الصنبور مطلوب للنقل الببتيد من السيتوبلازم إلى هيولى، ونقص الاستفادة من شدة يقلل تجمع الطبقة MHC المتاحة-ربط الببتيدات. نظراً لغياب الببتيدات، مجمع الوليدة MHC الفئة الأولى سلسلة ثقيلة وبيتا2-ميكروجلوبولين غير مستقر، أسفر عن MHC منخفضة جداً–أنا خلية التعبير السطحي. في البداية، مقارنة بين خلايا تي حفزت مع مستضد محملة على الاستفادة الكافية والماوس ناقص الجيش الملكي المغربي والجيش الملكي المغربي-S خطوط الخلايا، على التوالي، كناقلات الجنود المدرعة، لم تكشف عن أي أدلة لشركة أجونيسم خلال الماوس تنشيط خلية T18. ومع ذلك، لم يسمح استخدام هذا النظام التجريبي دقة السيطرة على مقدار الرهن مؤثر قدم مستقلة عن الرهن الذاتي غير محفزة. وعلاوة على ذلك، قد تختلف هذه الخطوط الخلية اثنين أيضا في التعبير عن الجزيئات الأخرى التي تعدل تنشيط خلية T، مثل يغاندس لمستقبلات خلية تي كوستيمولاتوري أو المثبطة، أو جزيئات الالتصاق.
وفي وقت لاحق، علينا وضع بروتوكول لتحميل خلايا تفتقر إلى TAP2 الجيش الملكي المغربي-S مع الببتيدات خارجية للسماح بعرض مبلغ ثابت للرهن العقاري مؤثر في وجود أو غياب للرهن العقاري غير محفزة. وقد تحقق ذلك من خلال ما يلي: الحضانة للجيش الملكي المغربي التي تفتقر إلى TAP2-S الخلايا عند درجات حرارة منخفضة (28 درجة مئوية، بدلاً من المعتاد 37 درجة مئوية) لتحقيق استقرار MHC فارغة الفئة الأولى سلسلة ثقيلة/β2 microglobulin مجمعات19؛ الحضانة عند 28 درجة مئوية مع الببتيد مؤثر خارجية؛ الحضانة عند 28 درجة مئوية في وجود أو عدم وجود الببتيد غير محفزة خارجية؛ والحضانة عند 37 درجة مئوية للحد من الخلايا السطحية التعبير عن MHC فارغة الفئة الأولى المجمعات8،9. استخدام هذا الإعداد التجريبية كشفت أن تعزيز الوجود للرهن العقاري غير محفزة التنشيط الماوس الثيموسيه والسذاجة الطرفية CD8 + “تي” الخلايا CTLs8. ميتشانيستيكالي، يمكن أن تحفز وجود الرهن غير محفزة CD8 التجنيد الخلية: APC تي المشبك محصنة حتى في الغياب للرهن العقاري مؤثر، والرهن غير محفزة ويمكن تعزيز التفاعل تكر مع CD8 التمييز7،8. ومع ذلك، لا يسمح هذا النظام التجريبي اختبار المساهمة النسبية لربط التمييز تكر و CD8 للرهن العقاري مؤثر ومؤثر المشارك في التوسط في تعزيز التنشيط، كالتعديلات أي تغيير الربط تكر أو CD8 للطبقة MHC أود أن تؤثر على جميع جزيئات MHC، بغض النظر عن عرض الببتيد. ولذلك استخدمنا الطبقة MHC أخص بسلسلة التكنولوجيا للتغلب على هذه المشكلة.
وقد استخدمت الطبقة MHC سلسلة واحدة (sc) تنسيق أنا قبل لتحسين عرض الرهن مولده للاستراتيجيات العلاجية، وللإجابة على أسئلة أساسية على آليات لتفعيل مستقبلات الخلية تكر وناغورني-كاراباخ وتعمل20،21 . سمك-الأول يتألف من الببتيد، β2-ميكروجلوبولين و MHC–أنا سلسلة ثقيلة وانضم اثنان linkers سيرين/جليكاين-الأغنياء مرنة (الشكل 1A)، كانت عدة تسلسلات مختلفة رابط طورت واختبرت22. سمك–يمكن أن أمثال مستقل عن برنامج المشورة التقنية المعقدة والبروتينات اللازمة للرهن العقاري التقليدية المعقدة الجمعية20لكوصي. سكمهك-وقد أظهرت أن يطوي بشكل صحيح، كما تحدد باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بتكيف تلطيخ22 وحل هيكل اتفاقية استكهولم مع23من البلورات بالأشعة السينية. سمك الأساسية–أنا تم تعديل التصميم لتحسين الربط تقارب منخفضة الببتيدات24،25.
يصف هذا البروتوكول استخدام سمك البشرية-الأول للتحقيق أجونيسم co أثناء CTL البشرية استنساخ التنشيط. تم تحسين البروتوكول لاستنساخ البشر CTL محددة حانمه فيروس التهاب الكبد B (HBV). HBV عبء الرعاية الصحية شديدة في جميع أنحاء العالم، كما أن هناك 350 مليون شخص مصاب بالتهاب وعدوى التهاب مزمنة يمكن أن تؤدي إلى تطوير سرطانه الخلية الكبدية (HCC). يمكن أن يقدم عادة [ابيتوبس] HBV-مشتقة الخلايا العقود الناجمة عن الإصابة بالتهاب ويمكن التعرف عليه بالخلايا التائية البشرية محددة. إزالة HBV والعقود يعتمد على ردود الخلية T البشرية26، لكن العقود المرضى الذين غالباً ما يعانون من استنفاد الخلايا T وانخفاض تي خلية الردود27. إدخال تكر HBV-خاصة في خلايا تي من HBV قد حوكم كاستراتيجية العلاج المناعي محتملة للقضاء على الإصابة بالتهاب مزمن28. بيد أنه غير معروف إذا كان هذا الأسلوب سوف تكون فعالة في إعداد سريرية، بسبب انخفاض مستويات MHC السطحية–أنا في خلايا الكبد البشري29. ولذلك، فهم إليه كواجونيسم قد توفر منظورات بديلة للعلاج المناعي HBV، ربما عن طريق تعزيز العرض التقديمي للرهن العقاري الذاتية للحث على ردود الخلية T co-أجونيسم-بوساطة. البروتوكول يغطي جميع الخطوات اللازمة للبحوث على البشرية co-أجونيسم: تعداء الخلايا تشو تي ركس مع الرهن العقاري اتفاقية استكهولم مؤثر ومؤثر المشارك، جيل خطوط الخلايا تشو تي ركس مستقرة، وثقافة محددة HBV البشرية CTL CD8 + “تي” خلية خط والتنشيط CTL تجارب قياس إنتاج سيتوكين وتحبب استجابة لخلايا تي ركس تشو. على الرغم من أن نركز على استخدام sc MHC الفئة الأولى تكنولوجيا للتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط خلية HBV T، وتجدر الإشارة إلى أن أساليب عرض يمكن تكييفها للبحوث المتعلقة بالجوانب الأخرى لتنشيط الخلية T بسهولة في النظم البشرية T الخلية مع الرهن العقاري معروفة–أنا خصوصية.
هذا البروتوكول يستخدم الإنسان CD8 + CTL خط محدد المستمدة من HBV الببتيد E183-91 (فلتريلتي: “E183”)30 قدم على هلا-A2. اتفاقية استكهولم هلا جزيئات تتكون من تسلسل إشارة من البشر β2-microglobulin، ببتيد ملزم هلا-A2 الاهتمام ورابط جليكاين/سيرين، β2-ميكروجلوبولين بشرية، ورابط جليكاين/سيرين و A2 من السلسلة الثقيلة يمكن أن يكون تجارياً تصنيعه (الشكل 1A ). والبلازميدات ترميز ثوابت scA2 مع الببتيد E183 مؤثر، أو “فيروس نقص المناعة البشرية” (سلينتفاتل) اسكت كواجونيست31 الببتيدات متوفرة من المؤلفين عند الطلب. يمكن تغيير تسلسل الببتيد باستخدام الطفرات الموجهة على الموقع. ناقل التتراسيكلين إيندوسيبلي pcDNA5/استخدم للتعبير عن سلسلة واحدة مؤثر هلا-A2 مع E183 الببتيد (sc E183-هلا-A2). حضور قامع التتراسكلين، pcDNA5 وإلى بلازميد يتيح التعبير فقط منخفضة جداً، “راشح” من بروتين الاهتمام؛ يمكن أن يتسبب التعبير عالية بإضافة التتراسيكلين (الشكل 1، ج). يسمح استخدام نظام التعبير التتراسيكلين إيندوسيبلي للسيطرة على مقدار خلية مؤثر سطحي الرهن التعبير. PcDNA3.1 تأسيسي تعبير بلازميد استخدمت للتعبير عن scA2 كواجونيست مع هفوة الببتيد (sc هفوة-هلا-A2). التعبير ينظم التتراسيكلين تشو (تي ركس) الخلية خط (خط الخلية الهامستر، لا MHC البشرية الذاتية) استخدمت للتعبير عن نيات sc-هلا-A2 مؤثر ومؤثر المشارك. ويسمح هذا النظام التجريبي تحكماً دقيقا في تقديم الرهن العقاري (الشكل 1): لا تقديم الرهن العقاري (أونترانسفيكتيد تي ريكس)، وعلى كمية عالية من تقديم الرهن العقاري مؤثر المشارك (sc التأسيسي التعبير هفوة-هلا-A2)، مبلغاً ضئيلا للرهن العقاري مؤثر العرض التقديمي (sc E183-هلا-A2 في الغياب من التتراسيكلين)، وعلى كمية عالية من مؤثر الرهن العرض التقديمي (sc E183-هلا-A2 حضور التتراسيكلين)، كمية منخفضة من تقديم الرهن العقاري مؤثر والتعبير عالية للرهن العقاري مؤثر المشارك (sc E183-هلا-A2 في نظراً لغياب التتراسيكلين، واتفاقية استكهولم التأسيسي التعبير هفوة-هلا-A2). يتيح استخدام هذا النظام التجريبي مراقبة دقيقة لمبالغ الخلية السطحية مؤثر والرهن كواجونيست.
ينص البروتوكول على تقديم أداة قوية لتحقيق تفاعلات الجزيئية أثناء تنشيط الخلية CD8 + “تي” البشرية. خطوة حاسمة لتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط الخلية تي البشرية هو السيطرة على الرهن العقاري مؤثر خلية التعبير السطحية لضمان مؤثر متساوية العرض الرهن على ناقلات الجنود المدرعة مع أو بدون مؤثر المشارك الرهن التعبير. في نظامنا التجريبية، ويتحقق ذلك باستخدام استنساخ خلية مفردة التعبير عن كميات قليلة من الرهن مؤثر، تليها سوبيرترانسفيكتيون مع مؤثر المشارك الرهن بناء ومؤثر الرهن تحديد كمي باستخدام الأجسام المضادة مثل تكر10، 32-كمؤثر sc الرهن التعبير يمكن أن تتغير بمرور الوقت، من الأهمية بمكان تحديد مقدار الرهن مؤثر التعبير السطحي على ناقلات الجنود المدرعة المستخدمة في كل تجربة باستخدام الأجسام المضادة مثل تكر. إذا كان متوفراً، لا جسم مثل تكر محددة مؤثر سكمهك–يمكن أن تكون معبراً الانصهار بروتين فلوري، وإعرابها سطح الخلية يمكن ثم قياسها كمياً باستخدام أسلوب الفحص المجهري حساسة، مثل انعكاس الداخلية مجموع الأسفار مجهرية 35 , 36-وعلاوة على ذلك، التعبير الخلية السطحية للرهن العقاري مؤثر المشارك تتناقص بمرور الوقت بسبب تعتمد على مثلايشن والمستقله إسكات مروج CMV37، وينبغي رصد استخدام جسم تلطيخ والتدفق الخلوي التحليل، مع المتكررة نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز عند الحاجة. ونحن قد مثقف شو الخلايا لمدة 5 أسابيع مع خسارة محدودة نسبيا للتعبير الرهن العقاري اتفاقية استكهولم. ونحن نوصي بشدة تجميد الخلايا تشو قريبا بعد اختيار/الفرز لضمان أسهم موثوقة للخلايا مع اتفاقية استكهولم المعروف MHC التعبير.
يمكن تعديل عدة خطوات للبروتوكولات المقدمة، رهنا بتوافر المعدات، أو اعتماداً على أهداف محددة للبحث. على سبيل المثال، ببمك الانتشار المحتملة يمكن أن تحول دون (الخطوة 3.2.1) باستخدام الطرق البديلة التي لا تتطلب غاما (أو X-) إيرادياتور، مثل المعاملة مع ميتوميسين ج38. يمكن استخدام المخازن مؤقتة تفكك خلية غير الانزيمية المحتوية على المعادن chelators39 بدلاً من خلية القشط في خطوة 3.3.1. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل مستضد تقديم النظام لجعله أكثر ملاءمة لاستنساخ الإنسان CTL الإعراب عن مختلف تكرس. شو الخلايا الهامستر التعبير عن MHC الفئة الأولى الجزيئات، وعلى الرغم من أن هذه ليست ذات صلة للسطر CTL درس هنا (الشكل 2A و الشكل 3 ألف، لاحظنا أية استجابات الخلية T إلى خلايا شو أونترانسفيكتيد)، هناك إمكانية أن تكرس البشرية الأخرى قد تظهر بعض إكسينوريكتيفيتي. في أن حالة، MHC الهامستر الفئة الأولى التعبير يمكن الحد من انقطاع الهامستر β2-ميكروجلوبولين أو الاستفادة من استخدام كريسبر/Cas9؛ أو يمكن استخدام خط APC بشرية بعد ضرب ميكروجلوبولين β2 كريسبر/Cas9-بوساطة أو الصنبور.
النظام التجريبي المقدمة هنا يتيح مراقبة دقيقة للتفاعلات تكر و CD8 مع جزيئات MHC عرض الببتيدات المعرفة مسبقاً. على سبيل المثال، نحن سابقا أظهرت أن الطفرات إلغاء CD8 ملزم40 للرهن العقاري كواجونيست القضاء على تعزيز تفعيل كواجونيست بوساطة في مورين والبشرية CD8 + “تي” الخلايا9،10، بينما يلغي تكر التفاعل مع الرهن مؤثر المشارك ليس أثر على تعزيز تفعيل وساطة كواجونيست10. ومع ذلك، قد استخدام ثوابت السلسلة واحدة MHC العديد من القيود. على سبيل المثال، أن الوقت قد حان والمستهلكة للعمل لاختبار متعددة المشارك مؤثر الببتيد تسلسل باستخدام هذا النظام التجريبي، كما يشمل هذا جيل البلازميدات متعددة ترميز sc MHC مع الببتيدات مختلفة، وترانسفيكشنز اللاحقة وفرز الخلايا. سابقا، استخدمنا خط الخلية تفتقر إلى الصنبور مورين RMA-S لاختبار متعددة الببتيدات مؤثر المشارك في الماوس تي خلية التنشيط8،9، ولكن هذا النهج لم يكن ناجحاً مع نقص الاستفادة البشرية T2 الخلية خط10، الأكثر احتمالاً بسبب عرض مستقلة عن الاستفادة من الببتيدات41. قيد آخر من نظامنا التجريبية أنها لا توفر طريقة سريعة لتغيير كمية الجزيئات الرهن مؤثر المشارك لغرض تحديد مقدار الرهن مؤثر المشارك المطلوبة لتشغيل تنشيط خلية T الحرجة. وعلاوة على ذلك، التتراسيكلين إيندوسيبلي المستخدمة لا يسمح النظام المعايرة لمؤثر كمية الرهن العقاري على مستوى الخلية الواحدة بتغيير تركيز التتراسيكلين، كما يغير متفاوتة تتراسكلين تركيز نسبة الخلايا A2 هلا إيجابية، وبدلاً من مستويات هلا-A2 على أساس كل خلية. نهج بديل ونحن نحقق حاليا هو استخدام الدهن معتمدة بليرس42، استخدمت سابقا للتحقيق أجونيسم co أثناء تنشيط الخلايا CD4 + T مورين4 أو الخرز تقديم مبلغ ثابت للرهن العقاري مؤثر في وجود كميات متفاوتة من الرهن مؤثر المشارك. عندما تستخدم بالاقتران مع التكنولوجيا الببتيد الأشعة فوق البنفسجية–كليفابل4،43، هذه النظم التجريبية البديلة ينبغي السماح باختبار سريع متعددة تسلسلات الببتيد مؤثر المشارك، فضلا عن مبالغ مختلفة للرهن العقاري مؤثر المشارك .
التكنولوجيا MHC اتفاقية استكهولم يمكن أن تكون أيضا تنطبق على التحقيق في أجونيسم co في خلايا CD4 تي البشرية أو مورين، واحد في سلسلة MHC class الثاني جزيئات تقديم تحدد مسبقاً الببتيدات عبرت بنجاح في خلايا الثدييات السطوح44. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع استخدام تكنولوجيا sc MHC لتحقيق جزيئات MHC غير الكلاسيكية مثل هلا-هاء- هلا Sc-ه قد وصفت قبل، والتعبير عنه قد ثبت أن تمنع تنشيط الخلية تي البشرية45. آخر جزيء MHC غير الكلاسيكية للاهتمام هو CD1، الذي يعرض الدهون بدلاً من الببتيدات46. اتفاقية استكهولم بنيات تتكون من سلسلة ثقيلة CD1 و β2-ميكروجلوبولين أظهرت أن يعبر على سطح الخلية وربط دهني ذات الصلة يغاندس47. واحد في سلسلة تكنولوجيا MHC إمكانات كبيرة كأداة بحث للتحقيق في التفاعلات الجزيئية أثناء تنشيط خلية تي وناغورني-كاراباخ.
The authors have nothing to disclose.
هذا البحث وأيده “مجلس البحوث الطبية الوطنية” سنغافورة التابعة لوزارة الصحة تحت كبرج/0064/2014 إلى N.R.J.G.، بإنشاء إطار به R571-002-012-592 إلى P.A.M.، “إينفيستيجاتورشيب مؤسسة البحوث الوطنية” R571-000-272-281 إلى P.A.M -، وعلى سنغافورة بحوث متعدية الجنسيات (STaR) محقق جائزة (نمرك/ستار/013/2012) إلى أتال بيهاري نحن ممتنون للدكتور بول هتشينسون، والسيد تيو قو هوي من المرافق “الأساسية تدفق البرنامج” اللائي يقبلن علم المناعة لفرز الخلايا الخبراء. ونحن ممتنون لتشن إيليا لقراءة نقدية من المخطوطة.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |