Этот протокол описывает использование одной цепи гистосовместимости комплексы для изучения молекулярных взаимодействий в активации клеток человека CD8 + T: поколение инженерии антиген представляющих клеток, выражая единую цепочку конструкции, культуры человеческого клона клеток CD8 + T и активация Т-клеток экспериментов.
Non стимулирующее самостоятельной пептидных комплексов MHC (реализует) не вызывают функции активации и эффекторных клеток T, но может повысить Т-клеток ответов реализует агонист, через процесс называется co агонизмом. Этот протокол описывает экспериментальной системы расследования co агонизмом во время активации клеток человека CD8 + T, выразив человека MHC I класса молекул, представив заранее пептидов как сингл полипептидов (одной цепи MHC) в линии культивированная клетки. Мы выразили единую цепь MHCs в условиях, где низкий уровень агонист единой цепи p-MHC комплексов и высокий уровень не стимулирующее одной цепи p-MHC комплексов были выражены. Использование этой экспериментальной системы позволило нам сравнить CD8 + Т-клеток ответов агонист реализует в наличие или отсутствие не стимулирующее реализует. Протокол описывает transfection клетки линии с одной цепи MHC конструкциями, поколение стабильной клеток линии, культуры клеток человека CD8 + T гепатитом вирус специфических и активация Т-клеток экспериментов одновременно количественного определения производство цитокинов и дегрануляции. Представленные методы могут использоваться для проведения исследований по различным аспектам CD8 + Т-клеток активации в системах человека Т-клеток с известных пептид MHC специфичности.
Гистосовместимости (MHC-I) молекулы представляют пептиды короткий (8-10 аминокислот), производным от Белки синтезируются в каждой ячейке. MHC-I молекулы на здоровые клетки представляют самостоятельной пептиды, полученные от эндогенных белков. Вирусная инфекция приводит к презентации несамоуправляющихся вирус производные пептидов на MHC-I, но даже инфицированные клетки нынешних несамоуправляющихся пептидов при наличии большого количества самостоятельной пептид MHC (реализует). MHC-я признан CD8 ко-рецептор на Т-клетки и Т-клеточных рецепторов (TCR). TCR сродство к пептид реализует сильно зависит от последовательности представленных пептиды, тогда как CD8 привязки пептид независимые. TCR привязки несамоуправляющихся агонист реализует комплекс приводит к активации и эффекторные функции Т-клеток. Non стимулирующее самостоятельно реализует комплексы не вызвать функции активации и эффекторных клеток T, но может повысить Т-клеток ответов реализует агонист, через процесс называется co агонизмом1,2,3. Co агонизмом наблюдается в мыши CD4 + T клетки4,5,6 , а также в человеческих CD8 + T клетки7,8,9,10, и мыши 11 , 12 , 13. в физиологических условиях, Т-клеток необходимо признать ограниченные количества агонист реализует на антиген представляющих клеток (БТР) совместного представления высокий уровень не стимулирующее реализует комплексов, предполагая, что co агонизмом способствует оптимальной T Мобильные ответы в естественных условиях. Общая клеток поверхности MHC класса я уровнях зачастую downregulated во время вирусных инфекций14 и15опухоли. Эта стратегия иммунной уклонение уменьшается агонист реализует презентации, но также уменьшает количество совместно агонист реализует я доступны для повышения активация Т-клеток. Кроме того высокая клеток поверхности выражение уровень MHC класса I молекулы HLA-C показали коррелируют с более ВИЧ управления16, предложив решающую роль для всего MHC класса выражение в активации клеток T. Несмотря на физиологическое значение co агонизмом его молекулярный механизм по-прежнему неполно понимается. Это обусловлено главным образом технические проблемы экспериментально контролировать количество представленных совместно агонист реализует сохраняя агонист реализует константа.
Мы разработали экспериментальный системы расследования co агонизмом во время активации клеток человека CD8 + T, выразив человека MHC I класса молекул, представив заранее пептид как одного полипептида (Одноместный цепи MHC-I, рис. 1A) в ячейке культивированная линия9,10. Агонист реализует единую цепь (sc) была выражена под контролем промотора тетрациклин индуцибельной в строке хомяк производные клеток T-REx Чо, выражая тетрациклин репрессор; Это позволяет очень низкий «Дырявый» выражение sc агонист реализует в отсутствие тетрациклин и высокого sc агонист реализует выражение после добавления тетрациклина (рис. 1BC). Sc агонист реализует выражая T-REx Чо клетки были затем supertransfected с стимулирующее, Сопредседатель агонист sc реализует-я под контролем промотора конститутивно активных (рис. 1BC). Использование этой экспериментальной системы позволило нам сравнить CD8 + Т-клеток ответов агонист реализует в наличие или отсутствие высокого уровня не стимулирующее реализует. Критически, начиная с пептида и MHC-я тяжелые цепи ковалентно связан в scMHC-формате, это позволяет интродукции мутаций в MHC молекулы, представив заранее пептиды. Использование scMHC-я технология таким образом позволил нам конкретно модулировать TCR или CD8-привязки свойства агонистов или совместного агонист реализует.
Co агонизмом в активации клеток CD8 + T наблюдается с использованием очищенного MHC-I комплексы, представляя агониста и Сопредседатель агонист пептидов в виде гетеродимерами11,17 или представленных на квантовых точек12,13. Ранние работы по co агонизмом в активации клеток CD8 + T в контексте признания реализует агониста на APC в качестве БТР TAP2-недостаточным клеточных линий. TAP необходим для транспортировки пептид из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум, и кран дефицит резко снижает в пул доступных MHC класса-привязки пептиды. В отсутствие пептиды, зарождающейся комплекс MHC класса I тяжелые цепи и β2– микроглобулина неустойчива, что приводит к очень низкой MHC-я клеток поверхности выражение. Первоначально сравнение Т-клеток, стимулируется с антигеном, загружены на TAP-достаточно – и несовершенным мыши RMA и RMA-S клеточных линий, соответственно, как БТР, не выявило каких-либо доказательств для co агонизмом во время мыши Т-клеток активации18. Однако использование этой экспериментальной системы не позволяют точно контролировать количество агонист реализует представил независимо от не стимулирующее самостоятельно реализует. Кроме того эти два клеточных линий могут также отличаться в выражение других молекул, которые модулируют активации Т-клеток, таких как лиганды рецепторов Т-клеток co-stimulatory или тормозящее или молекул адгезии.
Впоследствии мы разработали протокол для загрузки TAP2-недостаточным RMA-S клетки с экзогенной пептиды разрешить представление фиксированное количество агонист реализует в наличие или отсутствие не стимулирующее реализует. Это было достигнуто благодаря следующее: инкубационный TAP2-недостаточным RMA-S клеток при более низких температурах (28 ° C, вместо обычного 37 ° C) для стабилизации пустой MHC класса I тяжелые цепи/β2 микроглобулин комплексы19; Инкубация при 28 ° C с экзогенной агонист пептид; Инкубация при 28 ° C в присутствии или отсутствии внешних не стимулирующее пептид; и инкубации при 37 ° C для уменьшения поверхности выражение ячейку пустой MHC класса я комплексы8,9. Использование этой экспериментальной установки показали, что присутствие не стимулирующее реализует расширение активация тимоцитов мыши, наивно периферийных CD8 + Т-клеток и ЦТЛ8. Механически присутствие не стимулирующее реализует может вызвать CD8 набора для ячейки: APC иммунной синапса T даже в отсутствие агонист реализует, и не стимулирующее реализует может усилить взаимодействие TCR с CD8 coreceptor7,8. Однако эта экспериментальная система не позволяет тестирование относительного вклада TCR и CD8 coreceptor привязки агониста и Сопредседатель агонист реализует в посредничестве активации расширения, как любые изменения, изменяя TCR или CD8 привязки MHC класса, я бы влияет на все молекулы MHC, независимо от представленных пептид. Поэтому мы использовали MHC класса я одной цепи технологии для преодоления этой проблемы.
Класс MHC единой цепи (sc), которую я формат уже использовался для улучшения антигенной реализует презентации для терапевтических стратегий, фундаментальные вопросы о механизмах TCR и NK клеток рецепторов активации и функционируют20,21 . scMHC-я состоит из пептид, β2– микроглобулина и MHC-я тяжелые цепи, к которым присоединились два гибких Серин/глицин богатые линкеры (рис. 1A), несколько различных компоновщика последовательности были разработаны и протестированы22. scMHC-я могу сложить независимо от крана комплекс и шаперона белки, необходимые для обычных реализует комплекс Ассамблеи20. scMHC-у меня было показано сложить правильно, как определено с помощью конформации специфичные антитело пятная22 и решая sc структуры с рентгеноструктурного23. Основные scMHC-я был изменен дизайн для улучшения привязки низкого сродства пептиды24,25.
Этот протокол описывает использование человеческих scMHC-я расследовать co агонизмом во время человека CTL клонировать активации. Протокол был оптимизирован для человеческого клона CTL конкретных эпитопу вирусом гепатита в (HBV). HBV является тяжелым бременем здравоохранения во всем мире, как есть 350 миллионов человек, инфицированных ВГВ и хронической HBV инфекции может привести к развитию гепатоцеллюлярной карциномой (HCC). КЦУК клетки в результате инфекции ВГВ может обычно присутствуют ГВ производные эпитопов и могут быть признаны конкретного человека Т-клеток. ГВ и КЦУК Распродажа опирается на ответы клеток человека T26, но КЦУК пациенты часто страдают от истощения Т-клеток и снижение Т-клеток ответов27. Введение в Т-клетки ГВ ГВ конкретные TCR пробовало как потенциальной стратегии иммунотерапии для устранения хронической HBV инфекции28. Однако, это неизвестно, если этот метод будет эффективным в клинических условиях, из-за низкого уровня поверхности MHC-I в человека гепатоцитов29. Таким образом понимание механизма coagonism может предоставить альтернативные перспективы для иммунотерапии ГВ, возможно путем повышения презентации эндогенного реализует побудить co агонизмом опосредованной Т-клеток ответов. Протокол охватывает все необходимые шаги для проведения исследований на человека co агонизмом: transfection клеток T-REx Чо с агонистом и Сопредседатель агонист sc реализует, поколение стабильной T-REx Чо клеточных линий, культуры HBV-конкретного человека CTL CD8 + T линии клеток и активации CTL эксперименты, производство цитокинов и дегрануляции в ответ клетки T-REx Чо. Хотя мы сосредоточить внимание на использовании sc MHC класса I технологии расследовать co агонизмом во время активации клеток HBV T, необходимо отметить, что представленные методы может быть легко адаптирована для исследования других аспектов активация Т-клеток в клетки человека T системах с известными реализует-я специфика.
Этот протокол использует конкретного человека CD8 + CTL линии на ГВ производные пептид Е183-91 (FLLTRILTI: «Е183»)30 представлены по HLA-A2. молекулы HLA SC, состоящий из последовательности сигнала от человека β2-МИКРОГЛОБУЛИНА, HLA-A2 привязки пептид интерес, глицин/сериновые компоновщик, β2-микроглобулина человека, глицин/сериновые компоновщик и А2, тяжелые цепи могут быть коммерчески синтезированных (Рисунок 1A ). Плазмиды кодирования scA2 конструкции с агонистом Е183 пептид, или coagonist кляп ВИЧ (SLYNTVATL)31 пептиды доступны от авторов по запросу. Пептид последовательности могут быть изменены с помощью сайта направленного мутагенеза. Тетрациклин индуцибельной вектор pcDNA5/TO был использован выразить одной цепи агонист HLA-A2 с Е183 пептида (sc Е183-HLA-A2). Присутствии тетрациклин репрессор, pcDNA5/плазмида позволяет только очень низкая, «Дырявый» выражение протеина интереса; высокое выражение может быть вызвана добавлением Тетрациклин (рис. 1BC). Использование системы тетрациклин индуцибельной выражение позволяет контролировать количество клеток поверхности агонист реализует выражение. Учредительный выражение плазмида pcDNA3.1 был использован для Экспресс coagonist scA2 с кляп пептида (sc кляп-HLA-A2). Тетрациклин регулируемых выражение Чо (T-REx) клетки (линия хомячка клетки, не эндогенного человеческого MHC) был использован выразить конструкции агониста и Сопредседатель агонист sc-HLA-A2. Эта экспериментальная система позволяет точно контролировать реализует презентации (рис. 1 c): не реализует презентации (untransfected T-REx), большое количество совместно агонист реализует презентации (учредительных sc кляп-HLA-A2 выражение), низкое количество агонист реализует Презентация (sc Е183-HLA-A2 в отсутствие тетрациклина), большое количество агонист реализует презентации (sc Е183-HLA-A2 присутствии тетрациклина), низкое количество агонист реализует представления и высокой выражения реализует совместное агонистов (sc Е183-HLA-A2 в отсутствие тетрациклин и учредительные sc выражение кляп-HLA-A2). Использование этой экспериментальной системы позволяет точно контролировать поверхности количество клеток агониста и реализует coagonist.
Представленные протокол обеспечивает надежный инструмент для изучения молекулярных взаимодействий во время активации клеток человека CD8 + T. Важным шагом для расследования co агонизмом во время активации клеток человека T является контроль над агонист реализует клеток поверхности выражение для обеспечения равных агонист реализует презентации на БТР с или без совместного агонист реализует выражение. В нашей экспериментальной системы, это достигается с помощью одной ячейки клонов, выражая низкого количества реализует агонист, а затем supertransfection с совместного агонист реализует конструкцию и агонист реализует количественной оценки с использованием антител TCR-как10, 32. как агониста sc реализует выражение может меняться со временем, важно определить количественно агонист реализует поверхности выражение на БТР, используемых в каждом эксперименте с использованием антител TCR-как. Если доступен не конкретные TCR-как антитела, агонист scMHC-я может быть выражено как флуоресцентный белок fusion, и его выражение поверхности клетки затем могут быть количественно с помощью метода чувствительных микроскопии, такие как полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования 35 , 36. Кроме того, клетки поверхности выражение реализует совместное агонист уменьшается со временем, благодаря Метилировани зависимых и – независимый глушителей ЦМВ промоутер37и должны контролироваться с помощью антитело пятная и потока цитометрии анализа, с неоднократные СУИМ сортировка при необходимости. Мы культивируемых клеток Чо на срок до 5 недель с относительно ограниченной потерей sc реализует выражение. Мы настоятельно рекомендуем, замораживания Чо клетки вскоре после выбора/Сортировка обеспечить надежный запас клеток с известными sc MHC выражение.
Несколько шагов представленных протоколов можно изменить, в зависимости от наличия оборудования, или в зависимости от конкретных научно-исследовательских целей. Например, КСДОР распространения потенциал может быть ингибированный (шаг 3.2.1), с использованием альтернативных методов, которые не требуют гамма (или X-) облучатель, например лечение с митомицин C38. Буферы диссоциации неферментативного ячейки, содержащие металл хелаторов39 может использоваться вместо клеток, соскоб на шаге 3.3.1. Кроме того, антиген представляющих системы могут быть изменены, чтобы сделать его более подходящим для человеческих клонов CTL, выражая различные TCRs. Чо клетки Экспресс хомяка MHC I класса молекул, и хотя эти значения для линии CTL, учился здесь (рисунок 2A и На рисунке 3A, мы наблюдали нет Т-клеток ответов на untransfected Чо клетки), существует возможность, что другие человеческие TCRs может показать некоторые xenoreactivity. В случае, хомяк MHC I класса выражение может быть уменьшена путем стучать вне хомяка β2-microglubulin или КОСНИТЕСЬ помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9; или человеческой линии APC может использоваться после ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной β2-microglubulin или КОСНИТЕСЬ выбить.
Экспериментальная система, представленная здесь позволяет точное управление TCR и CD8 взаимодействия с молекулами MHC, представляя предопределенных пептиды. Например мы ранее показали, что мутации, отмены привязки CD840 до coagonist реализует ликвидировать coagonist опосредованной активации расширения в мышиных и человеческого CD8 + T клетки9,10, тогда как отмены TCR взаимодействие с совместного агонист реализует было не влияет на повышение coagonist опосредованной активации10. Однако использование единой цепи MHC конструкций имеет ряд ограничений. К примеру пришло время и трудоемкость для тестирования нескольких совместно агонист пептид последовательностей с помощью этой экспериментальной системы, как это предполагает поколения несколько плазмидов кодирования sc MHC с различных пептидов и последующей transfections и сортировки клеток. Ранее мы использовали мышиных TAP-недостаточным клеточная линия RMA-S для проверки нескольких совместно агонист пептидов в мыши Т-клеток активации8,9, но этот подход не был успешным с TAP-недостаточным человека T2 клеток линии10, скорее из-за представление TAP-независимые пептиды41. Еще одно ограничение нашей экспериментальной системы является не обеспечивает быстрый метод для изменения количества молекул реализует совместное агониста для целей определения критических количество реализует совместное агонист, необходимых для запуска активации Т-клеток. Кроме того тетрациклин индуцибельной система, используемая не позволяют титрования агониста реализует количество на уровне отдельной ячейки путем изменения концентрации тетрациклинов, как различной концентрации тетрациклинов изменяет доли положительных клеток HLA-A2, Вместо того чтобы HLA-A2 уровнях на основе за клеток. Альтернативный подход, который мы изучаем в настоящее время является использование поддерживаемых липидных бислоев42, ранее использовались для изучения co агонизмом во время активации клеток мышиных CD4 + T4 или бисер представляет фиксированное количество агонист реализует в наличие различную реализует совместное агониста. При использовании в сочетании с УФ горные пептид технология4,43, этих альтернативных экспериментальных систем должно позволить быстро тестирование нескольких совместно агонист пептида последовательности, а также различное количество совместно агонист реализует .
Sc MHC технология может быть также применимо к расследованию co агонизмом в человека или мышиных CD4 Т-клеток, как единая цепь MHC класса II молекул представляя предопределены пептиды были успешно выразили на поверхности клеток млекопитающих44. Кроме того использование технологии sc MHC может быть расширен для расследования неклассических MHC молекул, таких как HLA-E. SC HLA-E было описано ранее, и его выражение было показано, что подавляют активацию клеток человека Т45. CD1, который представляет липиды вместо пептиды46другой неклассических MHC молекулы интерес. SC конструкции, состоящей из тяжёлой цепи CD1 и β2-МИКРОГЛОБУЛИНА было показано выражаться на поверхности клеток и для связывания соответствующих липидов лигандов47. Одной цепи MHC технологии обладает большим потенциалом как средство исследования для изучения молекулярных взаимодействий во время активации T и NK клеток.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Министерством здравоохранения Сингапура Национальный совет медицинских исследований под его CBRG/0064/2014 до N.R.J.G., на создание под ее R571-002-012-592 абстрагироваться., Национальный исследовательский фонд Investigatorship R571-000-272-281 чтобы абстрагироваться . и премию следователь трансляционного исследования (звезда) Сингапур (NMRC/звезда/013/2012) для а.б. Мы благодарны д-р Пол Хатчинсон и г-н Тео Guo Хуэй из основного потока NUS иммунологии программы фонда для сортировки клеток экспертов. Мы благодарны Чэнь Elijah для критических чтении рукописи.
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |