该协议描述了利用单链 mhc i 类复合物研究人类 cd8 + t 细胞激活过程中的分子相互作用: 生成表达单链结构的工程抗原呈现细胞, 培养人类 cd8 + t 细胞克隆和 t 细胞活化实验。
非刺激自肽 mhc (pmhc) 复合物不诱导 t 细胞活化和效应功能, 但可以通过一种称为共激动剂的过程增强 t 细胞对激动剂 pmhc 的反应。该协议描述了一个实验系统, 通过表达人类 mhc i 类分子将预先确定的肽表示为单个多肽 (单链 mhc) 在异种细胞系中的共同激动作用。我们表达了单链 mhc 的条件下, 低浓度的激动剂单链 p-mhc 复合物和高水平的非刺激单链 p-mhc 复合物表达。使用这个实验系统, 使我们能够比较 cd8+ t 细胞对激动剂 pmhc 的反应, 在存在或不存在非刺激 pmhc。该协议描述了单链 mhc 结构的细胞系转染、稳定细胞系的生成、乙型肝炎病毒特异性人类 cd8+ t 细胞的培养以及 t 细胞活化实验, 同时定量地测定细胞因子的产生和实验。去造粒。该方法可用于已知肽 mhc 特异性的人 t 细胞系统中 cd8+ t 细胞活化的不同方面的研究。
mhc i 类 (mhc-i) 分子存在从每个细胞合成的蛋白质中提取的短 (8-10 氨基酸) 肽。健康细胞上的 mhc-i 分子产生来自内源性蛋白质的自肽。病毒感染导致非病毒衍生肽在 mhc-i 上出现, 但即使是受感染的细胞在存在大量自肽-mhc (pmhc) 的情况下也会出现非自肽。mhc-i 是由 t 细胞受体 (tcr) 和 cd8 在 t 细胞上的共受体识别。tcr 与肽 pmhc 的结合亲和力在很大程度上依赖于所呈现的多肽序列, 而 cd8 结合与肽无关。tcr 结合到非自激动剂 pmhc 复合物导致 t 细胞活化和效应因子功能。非刺激自 pmhc 复合物不诱导 t 细胞活化和效应因子功能, 但可以通过称为共激动剂1,2,3的过程增强 t 细胞对激动剂 pmhc 的反应。在小鼠 cd4 + t 细胞4、5、6以及小鼠 cd8 + t 细胞7、8、9、10中观察到了同体病。11,12,13. 在生理条件下, t 细胞需要在抗原呈现细胞 (apc) 上识别有限数量的抗物质 pmhc, 同时呈现高水平的非刺激 pmhc 复合物, 这表明共激动剂有助于最佳 t 型细胞细胞在体内的反应。在病毒感染14和肿瘤15期间, 总细胞表面 mhc i 级水平经常被降低。这种免疫逃避策略减少激动剂 pmhc 的呈现, 但也减少了可用于 t 细胞活化增强的共激动剂 pmhc i 的量。此外, mhc i 类分子 hla-c 的高细胞表面表达水平已被证明与改善的 hiv 控制相关16, 这表明 mhc i 类表达在 t 细胞活化中的总表达作用至关重要。尽管共激动有生理意义, 但其分子机制仍未完全了解。这在很大程度上是由于在保持激动剂 pmhc 不变的同时, 对共用激动剂 pmhc 的含量进行实验控制的技术挑战。
我们开发了一个实验系统, 通过将人类 mhc i 类分子表示为单个多肽 (单链 mhc-i,图 1a), 研究人类 cd8 + t 细胞活化过程中的共激动性第9行,第10行。单链 (sc) 激动剂 pmhc 在四环素抑制的仓鼠衍生 t-rex cho 细胞系中, 在四环素诱导启动子的控制下表达;这使得 sc 激动剂 pmhc 在没有四环素的情况下表达非常低的 “泄漏” pmhc, 在添加四环素后, sc 激动剂 pmhc 表达 (图 1b, c)。然后在一个有组织活性的启动子 (图1b, c) 的控制下, 用非刺激、共同激动剂 pMHC-expressing 超输转染 sc pMHC-expressing。使用这个实验系统, 使我们能够比较 cd8+ t 细胞对激动剂 pmhc 的反应, 在存在或不存在高水平的非刺激 pmhc。关键的是, 由于肽和 mhc-i 重链在 schc-i 格式中是共价连接的, 因此可以将突变引入 mhc 分子中, 呈现预先确定的肽。因此, 使用 scMHC-I 技术使我们能够专门调节激动剂或共激动剂 pmhc 的 tcr 或 cd8 结合特性。
cd8 + t 细胞活化中的共激动剂是用纯化的 mhc-i 复合物观察到的, 它以杂二的形式呈现激动剂和共激动肽11, 17 或在量子点12,13上呈现。早期在 apc 上的激动剂 pmhc 识别背景下 cd8+ t 细胞活化中的共激动性工作, 以 tap2 缺陷细胞系为 apc。tap 是从细胞质到内质网的多肽输运所必需的, tap 缺乏严重减少了可用 mhc i 型结合肽的池。在没有多肽的情况下, mhc i 类重链和β2-微球蛋白的新生复合物不稳定, 导致 mhc-i 细胞表面表达极低。最初, t 细胞的刺激抗原分别加载到 tap 足够和缺乏的小鼠 rma 和 rma-s 细胞系, 作为 apc, 没有发现任何证据表明在小鼠 t 细胞活化18期间共同激动。然而, 使用这个实验系统不允许精确控制的激动剂 pmhc 的数量提出独立于非刺激自我 pmhc。此外, 这两个细胞系在调节 t 细胞活化的其他分子的表达上也可能不同, 例如与 t 细胞共刺激或抑制受体的配体, 或粘附分子。
随后, 我们开发了一种将 tap2 缺乏的 rma-s 细胞与外源肽一起加载的协议, 以便在存在或不存在非刺激 pmhc 的情况下呈现固定数量的激动剂 pmhc。这是通过以下途径实现的: 在低温 (28°c, 而不是通常的 37°c) 下培养缺乏 tap2 的 rma-s 细胞, 以稳定空的 mhc i 类重链-2 微球蛋白复合物 19;外源性激动肽在28°c 孵育;在存在或不存在外源性非刺激肽的情况下, 在28°c 孵育;在37°c 孵育, 以减少空 mhc i 类复合物8,9的细胞表面表达。该实验装置的使用表明, 非刺激 pmhc 的存在增强了小鼠胸腺细胞、天真的外周 c8 + t 细胞和 ctl8的激活。在机械上, 非刺激 pmhc 的存在可以诱导 cd8 招募到 t 细胞: apc 免疫突触即使在没有激动剂 pmhc 的情况下, 非刺激 pmhc 也能增强与 cd8 受体7,8的 tcr 相互作用。然而, 这个实验系统不允许测试 tcr 和 cd8 受体结合激动剂和共激动剂 pmhc 在介导激活增强方面的相对贡献, 因为任何改变 tcr 或 cd8 结合到 mhc i 类的修改都会影响所有 mhc 分子, 而不考虑所呈现的肽。因此, 我们使用 mhc i 类单链技术来克服这个问题。
单链 (sc) mhc i 类格式已被用于改进抗原 pmhc 的治疗策略的呈现, 并回答有关 tcr 和 nk 细胞受体激活机制和功能20, 21 的基本问题.scMHC-I 由肽、β2-微球蛋白和 mhc-i 重链组成, 由两个灵活的富含糖的血清 (图 1a) 连接, 开发并测试了几种不同的链接剂序列22。scMHC-I 可以独立于传统 pmhc 复合物组装20所需的 tap 复合物和伴侣蛋白折叠.scMHC-I 已被证明是正确折叠, 这是用符合特异性抗体染色22和通过 x 射线晶体学解决 sc 结构23确定的。对基本的 scMHC-I 设计进行了改进, 以提高低亲和力肽24、25 的结合。
该协议描述了使用人 scMHC-I 来研究人 ctl 克隆激活过程中的共激动性。该协议针对乙型肝炎病毒表位的人 ctl 克隆进行了优化。乙肝病毒是全世界严重的医疗负担, 因为有3.5亿人感染了乙肝病毒, 慢性乙肝病毒感染可导致肝细胞癌 (hcc) 的发展。hbv 感染引起的 hcc 细胞通常会出现 hbv 衍生的表位, 并可被特定的人 t 细胞识别。hbv 和 hcc 清除依赖于人 t 细胞的反应26, 但 hcc 患者往往患有 t 细胞衰竭和减少 t细胞反应27。将 hbv 特异性 tcr 引入乙肝病毒 t 细胞已被尝试作为消除慢性乙肝病毒感染的潜在免疫治疗策略28。然而, 尚不清楚这种方法在临床环境中是否有效, 因为人类肝细胞29中的表面 mhc-i 水平较低。因此, 了解同角病的机制可以为乙肝病毒的免疫治疗提供替代的视角, 可能通过增强内源性 pmhc 的表达来诱导共视体介导的 t 细胞反应。该协议涵盖了研究人共激动症的所有必要步骤: t-rex cho 细胞与激动剂和共激动剂 pmhc 转染、生成稳定的 t-rex cho 细胞株、hbvva 特定人类 ctl ct8 + t 细胞株的培养和 ctl 激活实验量化细胞因子的产生和脱粒反应 t-rex cho 细胞。虽然我们专注于使用 sc mhc i 类技术来研究 hbv t 细胞激活过程中的共对抗, 但必须指出的是, 所提出的方法可以很容易地适应于已知的 pMHC-I 的人 t 细胞激活的其他方面的研究特 异性。
该协议使用 hla-a2 上介绍的 hla-a2 上介绍的 hlv 衍生肽 e183-91 (fllrilti: “e183”)30的人类 cd8 + ctl 线。sc hla 分子由来自人β2-微球蛋白的信号序列、感兴趣的 hla-a2 结合肽、甘氨酸酶链剂、人β-2-微球蛋白、甘氨酸衬里链接剂和 a2 重链组成, 可进行商业合成 (图 1 a)).作者可根据要求提供编码 sca2 结构的激动剂 e183 肽或异源 hiv gag (slyntvatl)31肽。多肽序列可以通过位点定向诱变改变。用四环素诱导载体 pcDNA5/TO 用 e183 肽 (sc e183-hla-a2) 表达了激动剂单链 hla-a2。在四环素抑制剂的存在下, pcDNA5/TO 到质粒只允许很低的、”漏水” 表达的蛋白质感兴趣;四环素的加入可以诱导高表达 (图 1b, c)。使用四联素诱导表达系统可以控制细胞表面激动剂 pmhc 表达的量。用 gag 肽 (sc gag-hla-a2) 表达辅酶的表达质粒 pcdna3.1。四环素调控表达 (t-rex) cho 细胞系 (仓鼠细胞系, 没有内源性人 mhc) 被用来表达激动剂和共效剂 sca-hla-a2 结构。该实验系统允许精确控制 pmhc 演示 (图 1c): 无 pmhc 演示 (未转染 t-rex), 大量的共激动剂 pmhc 演示 (本构 sc gag-hla-a2 表达式), 少量的激动剂 pmhc介绍 (sc e183-hla-a2 在没有四环素的情况下), 大量的激动剂 pmhc 表达 (sc e183-hla-a2 在四环素的存在下), 少量的激动剂 pmhc 表达和高表达的共效剂 pmhc (sc e183 hla-a2)。四环素的缺失, 和本构 sc gag-hla-a2 表达)。使用该实验系统可以精确控制细胞表面的激动剂和辅剂 pmhc 量。
该协议为研究人类 cd8+ t 细胞活化过程中的分子相互作用提供了一个可靠的工具。研究人 t 细胞活化过程中共激动的一个关键步骤是控制激动剂 pmhc 细胞表面表达, 以确保在有或不具有共激动剂 pmhc 表达的 apc 上的相同激动剂 pmhc 表达。在我们的实验系统中, 这是通过使用表达少量激动剂 pmhc 的单个细胞克隆来实现的, 然后是用共激动剂 pmhc 结构进行超输, 用 tcr 样抗体10进行激动剂 pmhc 定量,32. 由于激动剂 sc pmhc 表达会随着时间的推移而变化, 因此使用 tcr 样抗体量化每个实验中使用的 apc 上的激动剂 pmhc 表面表达至关重要。如果没有特定的 tcr 样抗体, 激动剂 scMHC-I 可以表示为荧光蛋白融合, 然后它的细胞表面表达可以用敏感的显微镜方法, 如总内部反射荧光显微镜进行量化35,36. 此外, 由于 cmv 启动子37的甲基依赖和独立沉默, 共激动剂 pmhc 的细胞表面表达会随着时间的推移而减少, 应使用抗体染色和流式细胞仪分析进行监测,在需要时重复进行 fas 排序。我们已经培养 cho 细胞长达 5周, sc pmhc 表达的损失相对有限。我们强烈建议在选择/分类后立即冻结 cho 细胞, 以确保已知的 sc mhc 表达的细胞的可靠库存。
所提出的协议的几个步骤可以修改, 这取决于设备的可用性, 也可以根据具体的研究目的进行修改。例如, 使用不需要伽玛 (或 x-) 辐照器的替代方法, 例如使用丝裂霉素 c38 治疗, 可以抑制 pbmc的增殖潜力 (步骤 3.2.1)。含有金属螯合剂39的非酶细胞分离缓冲液可以用来代替在3.3.1 的步骤中刮细胞。此外, 抗原呈现系统可以进行修改, 使其更适合表达不同 tcr 的人类 ctl 克隆. cho 细胞表达仓鼠 mhc i 类分子, 尽管这些与这里研究的 ctl 线无关 (图 2a和图 3a, 我们没有观察到 t 细胞对未转染的 cho 细胞的反应), 有可能是其他人类的 tcr 可能表现出一定的 x 反应性。在这种情况下, 仓鼠 mhc 一级表达可以通过敲出仓鼠β-2-微胶蛋白或 tap 使用 crispr/cas9 可以减少;或人类 apc 线可以使用后, crisprs9 介导β-微球蛋白或 tap 击倒。
这里介绍的实验系统可以精确控制 tcr 和 cd8 与 mhc 分子的相互作用, 这些分子呈现预定的肽。例如, 我们以前已经证明, 废除 cd8 结合 40到辅剂 pmhc 的突变消除了小鼠和人类 cd8 + t 细胞9,10的 coagonist 介导的激活增强, 而废除了 tcr与共激动剂 pmhc 的相互作用对共激动剂介导的激活增强10没有影响.然而, 使用单链 mhc 结构有几个限制。例如, 使用此实验系统测试多个共同激动剂肽序列是耗时和耗时的, 因为这涉及到产生具有不同肽的多个质粒编码 sc mhc, 以及随后的转染和细胞分选。以前, 我们使用小鼠 tap 缺乏细胞系 rma-s 来测试小鼠 t 细胞活化8,9中的多种共激动剂肽, 但这种方法在缺乏 tap 的人 t2 细胞系10中并不成功, 很有可能由于 tap 独立肽41的显示。我们实验系统的另一个局限性是, 不提供一个快速的方法来改变共激动剂 pmhc 分子的数量, 以确定触发 t 细胞活化所需的共激动剂 pmhc 的临界量。此外, 所使用的四环素诱导系统不允许通过改变四环素浓度在单个细胞水平上滴定激动剂 pmhc 量, 因为变化的四环素浓度改变了 hla-a2 阳性细胞的比例,而不是每个细胞的 hla-a2 水平。我们目前正在研究的另一种方法是使用支持脂质双层 42, 以前用于研究在小鼠 cd4+ t 细胞活化4或珠子提出固定数量的激动剂 pmhc存在不同数量的共激动剂 pmhc。当与 uv 裂解肽技术4,43一起使用时, 这些替代实验系统应允许快速测试多个共同激动剂肽序列以及不同数量的共同激动剂 pmhc.
mhc 技术也可用于研究人类或小鼠 cd4 t 细胞中的共激动性, 因为呈现预先确定肽的单链 mhc ii 类分子已在哺乳动物细胞表面44上成功表达。此外, sc mhc 技术的应用可以推广到 hla-e 等非经典 mhc 分子的研究。sc hla-e 已经被描述过, 其表达已被证明可以抑制人 t 细胞的激活45。另一个非经典的 mhc 分子感兴趣的是 cd1, 它呈现脂质而不是多肽46。由 cd1 重链和β2-微球蛋白组成的 sc 结构已被证明在细胞表面表达, 并结合相关的脂质 47。单链 mhc 技术作为研究 t 细胞和 nk 细胞活化过程中分子相互作用的研究工具具有巨大的潜力。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了新加坡卫生部国家医学研究委员会的支持, 该委员会的 cbrg额004年至 n. r. j. g., 由 create 在其 R571-002-012-592 到下午 a. m. 下, 国家研究基金会调查人员 r571-000-272-281 至下午晚些时候至下午晚些时候. 并由新加坡翻译研究调查员奖 (nmrc/star13 2012) 颁发给 a. b.。我们感谢 paul hutchinson 博士和 teo guo hui 先生, 他们来自 nus 免疫学项目流核心设施, 用于专家细胞分类。我们感谢陈伊利亚·尼以雅对手稿的批判性解读。
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |