Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

Summary

Aqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.

Abstract

A constatação de que a conhecida proteína p53 de mamíferos pode atuar como fator de transcrição (TF) na levedura S. cerevisiae permitiu o desenvolvimento de diferentes ensaios funcionais para estudar os impactos de 1) local de ligação [i.e., elemento de resposta (re)] variantes da seqüência na especificidade da transativação p53 ou 2) mutações TP53 , cofactores co-expressados, ou moléculas pequenas na atividade da transativação p53. Diferentes aplicações de pesquisa de base e translacional foram desenvolvidas. Experimentalmente, essas abordagens exploram duas grandes vantagens do modelo de levedura. Por um lado, a facilidade de edição do genoma permite a construção rápida de sistemas de repórter qualitativos ou quantitativos, explorando cepas isogênicas que diferem apenas ao nível de um específico p53-RE para investigar a especificidade da seqüência de p53-dependente transactivacao. Por outro lado, a disponibilidade de sistemas regulamentados para a expressão ectópica do p53 permite a avaliação da transativação em uma ampla gama de expressão protéica. Revisados neste relatório são amplamente utilizados sistemas que são baseados em genes de repórter de cor, luciferase, e o crescimento de levedura para ilustrar suas principais etapas metodológicas e para avaliar criticamente o seu poder preditivo. Além disso, a extrema versatilidade dessas abordagens pode ser facilmente explorada para estudar diferentes TFs, incluindo P63 e p73, que são outros membros da família gene TP53 .

Introduction

A transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo a organização dinâmica, espacial e temporal de fatores de transcrição (TFs) e cofatores para o recrutamento e modulação de polimerases de RNA em regiões de cromatina em resposta a estímulos específicos¹ . A maioria dos TFs, incluindo o supressor do tumor p53 humano, reconhecem elementos específicos de ação cis na forma de seqüências de DNA chamados elementos de resposta (REs), que consistem em únicos (ou múltiplos) motivos únicos ~ 6-10 nucleotídeos longos. Dentro desses motivos, posições individuais podem mostrar vários graus de variabilidade², geralmente resumidos por matrizes de peso de posição (PWM) ou logotipos^3,4.

O fermento S. cerevisiae é um sistema modelo adequado para o estudo de diferentes aspectos das proteínas humanas através de ensaios de complementação, expressão ectópica e ensaios funcionais, mesmo quando um gene de levedura ortologica não está presente^{5, 6} anos de ^{, 7}. devido à conservação evolutiva dos componentes basais do sistema transcricional⁸, muitos TFs humanos (quando ectopicamente expressos em células de levedura) pode modular a expressão de um gene repórter, agindo através de promotores projetados para contêm REs apropriados. O sistema de modelo de transcrição aqui apresentado para a p53 humana é caracterizado por três grandes variáveis cujos efeitos podem ser modulados: 1) a modalidade de expressão e tipo de p53,2) a seqüência RE controlando a transcrição dependente do p53, e 3) o tipo de gene repórter (Figura 1a).

Em relação à modalidade de expressão da p53, S. cerevisiae possibilita a escolha de promotores indutivos, represáveis ou constituintes^9,10,11. Em particular, o promotor GAL1 induzível permite basal (usando rafinose como uma fonte de carbono) ou variável (alterando a quantidade de galactose na mídia) expressão de um TF em levedura. De fato, a expressão finamente sintonável representa um desenvolvimento crítico para estudar não apenas o p53 propriamente dito, mas também outras proteínas da família p53^12,13.

Em relação ao tipo de REs que controla a expressão dependente do p53, S. cerevisiae permite a construção de diferentes cepas de repórter possuindo diferenças únicas no re de interesse em um fundo isogênico de outra forma. Esse objetivo é atingido por meio de uma adaptação de uma abordagem de edição de genoma particularmente versátil desenvolvida em S. cerevisiae, denominada Delitto Perfetto¹²,^14,15,16.

Além disso, diferentes genes de repórter (i.e., URA3, HIS3 e ADE2) podem ser usados para avaliar qualitativamente e quantitativamente as atividades transcricional do TFs humano em S. cerevisiae, cada uma com características específicas que podem ser adaptados às necessidades experimentais^{17,18,19,20,21}. A expressão destes genes do repórter confere o uracil, o histidine, e o prototrophy do adenina, respectivamente. O URA3 reporter não permite o crescimento de células na presença de 5-Foa também, e, portanto, pode ser contraselecionado. O sistema ADE2 reporter tem a vantagem de que, além da seleção nutricional, permite a identificação de células de levedura que expressam Wild-Type (ou seja, funcional na expressão ADE2 ) ou mutante (ou seja,não funcional em ADE2 ) P53 da cor da colônia.

Por exemplo, as células de levedura que expressam o gene ADE2 geram colônias brancas normalmente dimensionadas em placas contendo quantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), enquanto aquelas que mal ou não transtranscriam aparecem na mesma placa que o vermelho menor (ou rosa) Colônias. Isto é devido ao acúmulo de um intermediário na via de adenina biossintética (i.e., P-ribosylamino-imidazol, que tem sido anteriormente chamado de amino-imidazol aminoimidazole ou ar), que é convertido para formar um pigmento vermelho. A cor qualitativa baseada ADE2 gene do repórter foi substituída já com o Firefly quantitativo Photinus Tânia (LUC1)^12,22. Mais recentemente, o repórter ADE2 foi combinado com o repórter de lacZ em um fácil-à-contagem, semi-quantitativo, ensaio dobro do repórter que pode ser explorado para subclassificar os mutantes p53 de acordo com seu nível residual de funcionalidade ^{a 23}.

Os repórteres fluorescentes tais como EGFP (proteína fluorescente verde aumentada) ou dsred (proteína fluorescente vermelha de discosoma SP.) foram usados igualmente para a avaliação quantitativa da atividade do transactivacao associada com todas as mutações missense possíveis no TP53 seqüência de codificação²⁴. Por fim, a chance de combinar promotores sintonáveis para a expressão do alelo p53 com cepas de levedura isogênicas diferindo para o gene RE e/ou repórter levou ao desenvolvimento de uma matriz de dados que gera uma classificação refinada de câncer associado e germline alelos p53 do mutante^25,26,27.

As abordagens descritas acima são usadas para medir a atividade transcricional da proteína p53. No entanto, a expressão de p53 do tipo Wild no fermento S. cerevisiae²⁸ e Schizosaccharomyces pombe²⁹ pode causar retardo de crescimento, que tem sido associado à parada do ciclo celular^28,30 ou morte celular³¹. Em ambos os casos, a inibição do crescimento do fermento é desencadeada pela expressão p53 elevada e foi correlacionada com a modulação transcricional potencial de genes endógenos do fermento envolvidos no crescimento da pilha. Suportando esta hipótese, o mutante da perda–função p53 R273H não interferiu com crescimento da pilha do fermento quando expressado em níveis similares como selvagem-tipo p53³². Inversamente, a expressão no fermento do mutante tóxico p53 V122A (sabido para uma atividade transcricional mais elevada comparada ao selvagem-tipo p53) causou um efeito inibitório do crescimento mais forte do que o selvagem-tipo p53³².

Adicionalmente, demonstrou-se que a MDM2 humana foi capaz de inibir a atividade transcricional p53 humana em levedura, promovendo sua ubiquitinação e subsequente degradação³³. Conformemente, a habilidade do Mdm2 humano e do MDMX de inibir a inibição p53-induzida do crescimento do fermento foi demonstrada^32,34. Em um estudo adicional, estabeleceu-se uma correlação entre a atividade transcricional p53 e os níveis de expressão de actina, com a identificação de uma putativa p53 RE upstream no gene Act1 em levedura³². Consistentemente, a expressão do actínio foi aumentada pelo selvagem-tipo p53 e ainda mais por p53 V122A, mas não pelo mutante p53 R273H. Inversamente, a expressão do actina pelo p53 diminuiu na copresença de inibidores p53 Mdm2, MDMX, ou pifithrin-α (um inibidor da pequeno-molécula da atividade transcricional p53), consistente com os resultados baseados no ensaio do fermento-crescimento. É importante ressaltar que esses resultados estabeleceram uma correlação entre a inibição do crescimento induzida pela p53 e o grau de sua atividade na levedura, que também foi explorada para identificar e estudar pequenas moléculas modulando as funções p53^{28,34 , 35}.

Protocol

1. construção de cepas de levedura ADE2 ou LUC1 repórter contendo um re específico (Yafm-re ou ylfm-re) Raia uma estirpe yafm-iCore ou ylfm-iCore12,14 (iCore = i, ISCe-i endonuclease GAL1 promotor; CO = contador selecionável URA3; RE = repórter KanMX4 conferindo resistência à kanamicina; Tabela 1) de um estoque de glicerol a 15% armazenado em-80 ° c em uma placa de agar YPDA (<strong…

Representative Results

Construção de ADE2 ou LUC1 cepas de levedura repórter ODelitto perfettoapproach12,14,15,16 foi adaptado para possibilitar a construção de cepas de levedura de repórter p53 (<strong clas…

Discussion

Os ensaios baseados em leveduras provaram ser úteis para investigar vários aspectos das funções da proteína p53. Esses ensaios são particularmente sensíveis para avaliar o potencial de transativação do p53 em relação a variantes de sítios alvo de RE, incluindo a avaliação de polimorfismos funcionais. O uso de repórteres de cor, bem como a miniaturização do resultado do ensaio luciferase em ensaios de custo-benefício e relativamente escalável. Além disso, o teste de inibição do crescimento é potenci…

Materials

L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500