Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Summary

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Abstract

Die Feststellung, dass das bekannte Säugetier-P53-Protein als Transkriptionsfaktor (TF) in der Hefe S. cerevisiae fungieren kann, hat die Entwicklung verschiedener funktioneller Assays ermöglicht, um die Auswirkungen von 1) Bindungsstellen zu untersuchen [d.h. Das Ansprechelement (RE)] Sequenzvarianten auf P53-Transaktivierungsspezifität oder 2) TP53-Mutationen, koexprimierte Kofaktoren oder kleine Moleküle bei P53-Transaktivierungsaktivität. Es wurden verschiedene Basis- und translationale Forschungsanwendungen entwickelt. Experimentell nutzen diese Ansätze zwei wesentliche Vorteile des Hefemodells aus. Einerseits ermöglicht die einfache Genombearbeitung den schnellen Aufbau qualitativer oder quantitativer Reportersysteme, indem isogene Stämme genutzt werden, die sich nur auf der Ebene eines spezifischen P53-RE unterscheiden, um die sequenzionizifizium abhängige P53-abhängige Transaktivierung. Andererseits ermöglicht die Verfügbarkeit regulierter Systeme für die ektopische P53-Expression die Auswertung der Transaktivierung in einer Vielzahl von Proteinexpressionen. Bewertet in diesem Bericht sind ausgiebig verwendete Systeme, die auf Farbreporter-Gene, Luziferase und das Wachstum von Hefe basieren, um ihre wichtigsten methodischen Schritte zu veranschaulichen und ihre Vorhersagekraft kritisch zu bewerten. Darüber hinaus kann die extreme Vielseitigkeit dieser Ansätze leicht genutzt werden, um verschiedene TFs zu untersuchen, einschließlich P63 und P73, die andere Mitglieder der TP53-Genfamilie sind.

Introduction

Die Transkription ist ein äußerst komplexer Prozess, bei dem die dynamische, räumliche und zeitliche Organisation von Transkriptionsfaktoren (TFs) und Kofaktoren für die Rekrutierung und Modulation von RNA-Polymerasen in Chromatinregionen als Reaktion auf spezifische Reize¹ . Die meisten TFs, einschließlich des menschlichen P53-Tumorsuppressors, erkennen bestimmte cis-wirkende Elemente in Form von DNA-Sequenzen, sogenannten Response-Elementen (REs), die aus einzelnen (oder mehreren) einzigartigen Motiven bestehen, die 6-10 Nukleotide lang sind. Innerhalb dieser Motive können einzelne Positionen verschiedene Variabilitätsgrade²aufweisen, in der Regel nach Positionsgewichtsmatrizen (PWM) oder Logos^3,4zusammengefasst.

Die Hefe S. cerevisiae ist ein geeignetes Modellsystem zur Untersuchung verschiedener Aspekte menschlicher Proteine durch Komplementierungs-Assays, ektopische Expression und funktionelle Assays, selbst wenn ein orthologoxes Hefegen nicht vorhanden ist^{5, 6 , 7}. Aufgrund der evolutionären Konservierung von Basalkomponenten des Transkriptionssystems⁸können viele menschliche TFs (wenn sie ektopisch in Hefezellen ausgedrückt werden) die Expression eines Reportergens modulieren, indem sie durch Promotoren wirken, die entsprechende REs enthalten. Das hier vorgestellte Transkriptionsmodellsystem für humane P53 zeichnet sich durch drei Hauptvariablen aus, deren Wirkungen moduliert werden können: 1) die Modalität der Expression und Art von P53, 2) die RE-Sequenz, die P53-abhängige Transkription steuert, und 3) die Art der Reportergen (Abbildung 1A).

Hinsichtlich der Modalität des P53-Ausdrucks ermöglicht S. cerevisiae die Wahl zwischen induzierbaren, druckbaren oder konstitutiven Promotoren^9,10,11. Insbesondere erlaubt der induzierbare GAL1-Promotor die basale (mit Raffinose als Kohlenstoffquelle) oder variable (durch Änderung der Galaktosemenge in den Medien) Expression eines TF in Hefe. Tatsächlich stellt der fein abgestimmte Ausdruck eine kritische Entwicklung dar, um nicht nur P53 selbst, sondern auch andere Proteine der P53-Familie^12,13zu studieren.

In Bezug auf die Art der REs, die den P53-abhängigen Ausdruck steuern, ermöglicht S. cerevisiae die Konstruktion verschiedener Reporterstämme, die einzigartige Unterschiede im RE-Interesse in einem ansonsten isogenen Hintergrund aufweisen. Dieses Ziel wird mit einer Anpassung eines besonders vielseitigen Genom-Editing-Ansatzes erreicht, der in S. cerevisiaeentwickelt wurde, genannt delitto perfetto^12,14,15,16.

Darüber hinaus können verschiedene Reportergene (d. h. URA3, HIS3 und ADE2) verwendet werden, um transkriptionelle Aktivitäten menschlicher TFs in S. cerevisiaequalitativ und quantitativ zu bewerten. auf experimentelle Bedürfnisse zugeschnitten sein^{17,18,19,20,21}. Die Expression dieser Reportergene verleiht Uracil, Histidin und Adeninprototrophie. Der URA3-Reporter lässt auch das Wachstum von Zellen in Gegenwart von 5-FOA nicht zu und kann somit gegengewählt werden. Das ADE2-Reportersystem hat den Vorteil, dass es neben der Ernährungsauswahl die Identifizierung von Hefezellen ermöglicht, die Wildtyp (d. h. funktional bei ADE2-Expression) oder mutiert (d. h.nicht funktionsfähig auf ADE2) exprimieren. ) P53 aus der Koloniefarbe.

Zum Beispiel erzeugen Hefezellen, die das ADE2-Gen exzieren, normalerweise große weiße Kolonien auf Platten, die begrenzende Mengen an Adenin (2,5-5,0 mg/L) enthalten, während solche, die es schlecht oder nicht transkribieren, auf derselben Platte wie kleinere rote (oder rosa) Kolonien. Dies ist auf die Anhäufung eines Zwischenprodukts im Biosynthetischen Adenin (d. h. P-Ribosylamino-Imidazol, das zuvor Amino-Imidazol-Ribot oder AIR genannt wurde), das zu einem roten Pigment umgewandelt wird. Das qualitative farbbasierte ADE2-Reportergen wurde seitdem durch das quantitative Firefly Photinus pyralis (LUC1)^12,22ersetzt. In jüngerer Zeit wurde der ADE2-Reporter mit dem lacZ-Reporter in einem leicht zu bewertenden, semi-quantitativen Doppelreporter-Assay kombiniert, der genutzt werden kann, um P53-Mutanten nach ihrem Restfunktionsgrad ^{zu unterklassifizieren. 23}.

Fluoreszierende Reporter wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein) wurden auch für die quantitative Bewertung der Transaktivierungsaktivität im Zusammenhang mit allen möglichen Missense-Mutationen in der TP53-Codierungssequenz²⁴. Schließlich hat die Chance, abstimmbare Promotoren für die P53-Allelexpression mit isogenen Hefestämmen zu kombinieren, die sich für das RE- und/oder Reportergen unterscheiden, zur Entwicklung einer Datenmatrix geführt, die eine verfeinerte Klassifizierung von krebsassoziierter und Keimbahn erzeugt. Mutante P53 Allele^25,26,27.

Die oben beschriebenen Ansätze werden verwendet, um die Transkriptionsaktivität des P53-Proteins zu messen. Die Expression von Wildtyp P53 in der Hefe S. cerevisiae²⁸ und Schizosaccharomyces pombe²⁹ kann jedoch zu Wachstumsverzögerungen führen, die mit Zellzyklusstillstand^28,30 oder Zelltod³¹. In beiden Fällen wird die Hefewachstumshemmung durch eine hohe P53-Expression ausgelöst und mit einer möglichen transkriptionellen Modulation endogener Hefegene korreliert, die am Zellwachstum beteiligt sind. Zur Untermauern dieser Hypothese störte der Funktionsverlustmutant P53 R273H das Wachstum der Hefezellen nicht, wenn er auf ähnlichen Ebenen wie wildartig P53³²ausgedrückt wurde. Umgekehrt verursachte die Expression des toxischen Mutanten P53 V122A (bekannt für eine höhere Transkriptionsaktivität im Vergleich zum Wildtyp P53) in Hefe eine stärkere wachstumshemmende Wirkung als der Wildtyp P53³².

Zusätzlich wurde gezeigt, dass humanes MDM2 in der Lage war, die menschliche P53-Transkriptionsaktivität in Hefe zu hemmen und seine Ubiquitination und den anschließenden Abbau zu fördern³³. Dementsprechend wurde die Fähigkeit von humanem MDM2 und MDMX, P53-induzierte Hefewachstumshemmung zu hemmen,^32,34gezeigt. In einer zusätzlichen Studie wurde eine Korrelation zwischen der Transkriptionsaktivität P53 und den Actin-Expressionsspiegeln festgestellt, wobei ein vermeintliches P53 RE vor dem ACT1-Gen in Hefe³²identifiziert wurde. Konsequentwurde die Actin-Expression durch den Wildtyp P53 und noch mehr durch P53 V122A, nicht aber durch mutierte P53 R273H verstärkt. Umgekehrt verringerte sich die Aktinexpression durch P53 in der Kopräsenz der P53-Inhibitoren MDM2, MDMX oder Pifithrin-A (ein kleinmolekularer Inhibitor der P53-Transkriptionsaktivität), die mit den Ergebnissen auf der Grundlage des Hefewachstums-Assays übereinstimmten. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse eine Korrelation zwischen der P53-induzierten Wachstumshemmung und dem Grad ihrer Aktivität in Hefe feststellten, die auch genutzt wurde, um kleine Moleküle zu identifizieren und zu untersuchen, die P53-Funktionen modulieren^{28,34 , 35}.

Protocol

1. Bau von ADE2- oder LUC1-Reporterhefestämmen, die einen spezifischen RE (yAFM-RE oder yLFM-RE) enthalten Streak a yAFM-ICORE oder yLFM-ICORE Stamm12,14 (ICORE = I, ISce-I Endonuklease unter GAL1 Promoter; CO = zählerlich wählbar URA3; RE = Reporter KanMX4 verleiht Kanamycin-Widerstand; Tabelle 1) aus einem 15% Glycerinbestand, der bei -80 °C auf einer YPDA-Agarplatte gelagert wird (<st…

Representative Results

Bau von ADE2 oder LUC1 Reporter Hefe-Stämme Derdelitto perfettoapproach12,14,15,16 wurde angepasst, um den Bau von P53 Reporter Hefestämmen zu ermöglichen ( Abbildung1…

Discussion

Hefebasierte Assays haben sich als nützlich erwiesen, um verschiedene Aspekte der P53-Proteinfunktionen zu untersuchen. Diese Assays sind besonders empfindlich für die Bewertung des P53-Transaktivierungspotenzials gegenüber Varianten von RE-Zielstandorten, einschließlich der Bewertung funktioneller Polymorphismen. Der Einsatz von Farbreportern sowie die Miniaturisierung des Luziferase-Assays führen zu kostengünstigen und relativ skalierbaren Assays. Außerdem ist der Wachstumsinhibitionstest potenziell für den Ein…

Materials

L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500