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Cancer Research

ヒトP53を研究する機能アッセイを開発するシャーシとしての酵母

Published: August 04, 2019
doi:
10.3791/59071
, , , , ,
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit,Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO,University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy,University of Porto

Summary

ここでは、ヒトP53トランス活性化の可能性、その様々な癌関連変異の影響、共発現相互作用タンパク質、および酵母サッカロマイセスセレビシエレポーター株を構築し、利用するための4つのプロトコルを示します。特定の低分子の効果。

Abstract

よく知られている哺乳動物P53タンパク質が酵母S.セレビシエにおける転写因子(TF)として作用し得ることを知ることは、1)結合部位(すなわち、応答元素(RE)の影響を研究するための異なる機能的アッセイの開発を可能にした。P53トランス活性化特異性または2)TP53変異、共発現共起因子、またはP53トランス活性化活性上の小分子に関する配列変異。異なる基礎研究および翻訳研究アプリケーションが開発されました。実験的に、これらのアプローチは酵母モデルの2つの主要な利点を利用する。一方、ゲノム編集の容易さは、特定のP53-REのレベルでのみ異なるアイソジェニック株を利用して、P53依存性の配列特異性を調べることにより、定性的または定量的レポーターシステムの迅速な構築を可能にします。トランスアクティベーション。一方、異所性P53発現に対する調節システムの利用可能性は、広範囲のタンパク質発現におけるトランス活性化の評価を可能にする。この報告書でレビューされているのは、カラーレポーター遺伝子、ルシフェラーゼ、酵母の成長に基づく広範に使用されるシステムであり、その主な方法論的ステップを説明し、その予測力を批判的に評価する。さらに、これらのアプローチの極端な汎用性は、TP53遺伝子ファミリーの他のメンバーであるP63およびP73を含む異なるTFを研究するために容易に利用することができる。

Introduction

転写は、転写因子(TF)の動的、空間的、時間的組織を含む非常に複雑なプロセスであり、特定の刺激に応答してクロマチン領域におけるRNAポリメラーゼンの募集および変調のための共因子である1.ヒトP53腫瘍抑制剤を含むほとんどのTFは、単一(または複数の)ユニークなモチーフから成る応答要素(REs)と呼ばれるDNA配列の形で特定のシス作用要素を認識し、単一(または複数)のユニークなモチーフから成る〜6〜10ヌクレオチドを長くする。これらのモチーフの中で、個々の位置は、様々な程度の変動性2を示し、通常、位置重量行列(PWM)またはロゴ3、4によって要約される。

酵母S.セレビシエは、補体アッセイ、異所性発現、および機能アッセイを通じてヒトタンパク質の異なる側面を研究するための適切なモデルシステムであり、たとえ外来酵母遺伝子が存在しない場合でも5、6,7.転写系8の基底成分の進化的保存により、多くのヒトTF(酵母細胞で異所発現した場合)は、導約されたプロモーターを介して作用することによってレポーター遺伝子の発現を調節することができる。適切な R が含まれています。ヒトP53のためにここに提示された転写モデルシステムは、効果を変調することができる3つの主要な変数によって特徴付けられます:1)P53の発現とタイプのモダリティ、2)P53依存転写を制御するRE配列、および3)のタイプレポーター遺伝子(図1A)。

P53発現のモダリティに関して、S.cerevisiaeは、誘導性、抑圧性、または構成的プロモーター9、10、11の選択を可能にする。 特に、誘導性GAL1プロモーターは、酵母におけるTFの発現(炭素源としてラフィノースを用いる)または可変(培地中のガラクトースの量を変化させることによって)を可能にする。実際、微細に微細に微細に発現することは、P53自体だけでなく、他のP53ファミリータンパク質12、13を研究するための重要な開発を表す。

P53依存式を制御するREのタイプに関しては、S.cerevisiaeは、そうでなければ同種の背景に関心のあるREのユニークな違いを有する異なるレポーター株の構築を可能にする。この目標は、S.セレビシエで開発された特に汎用性の高いゲノム編集アプローチの適応を用いて達成され、デリット・パーフェット12、14、15、16と呼ばれる。

さらに、異なるレポーター遺伝子(すなわち、URA3、HIS3、およびADE2)は、S.セレビシエにおけるヒトTFの転写活性を定性的かつ定量的に評価するために使用することができ、それぞれが特定の特徴を有する実験的ニーズに合わせて調整される17,18,19,20,21.これらのレポーター遺伝子の発現は、それぞれウラシル、ヒスチジン、アデニンプロトトロフィーを付与する。URA3レポーターは、5-FOAの存在下での細胞の増殖も許可しないため、逆選択することができます。ADE2レポーターシステムは、栄養選択に加えて、野生型(すなわち、ADE2発現で機能的)または変異体(すなわち、ADE2上では機能しない)を発現する酵母細胞の同定を可能にするという利点を有する。)コロニー色からP53。

例えば、ADE2遺伝子を発現する酵母細胞は、制限量のアデニン(2.5-5.0 mg/L)を含むプレート上に通常サイズの白いコロニーを生成するが、不十分または転写しないものは、より小さい赤(またはピンク)と同じプレートに現れる。コロニー。これは、アデニン生合成経路における中間体の蓄積(すなわち、以前はアミノイミダゾールリボチドまたはAIRと呼ばれてきたP-リボシラミアミノアミノイミダゾール)に蓄積され、これは赤色顔料を形成するために変換される。定性的色ベースのADE2レポーター遺伝子は、その後、定量的なホタルホチホチピナスピラリス(LUC1)12、22に置き換えられました。最近では、ADE2レポーターはlacZレポーターと組み合わせることで、機能の残りのレベルに応じてP53変異体をサブ分類するために利用できる簡単に得点、半定量、ダブルレポーターアッセイを行っています。23.

EGFP(増強された緑色蛍光タンパク質)またはDsRed(ディスコスコスマsp. 赤色蛍光タンパク質)などの蛍光レポーターは、全ての誤解変異に関連するトランス活性化活性の定量評価にも使用されています。TP53コーディング シーケンス24.最後に、P53対立遺伝子発現の調節性プロモーターと、RE遺伝子および/またはレポーター遺伝子と異なる同種酵母株を組み合わせる可能性は、癌関連および生殖細胞系列の精製分類を生成するデータマトリックスの開発につながった。変異体P53ア列25、26、27.

上述のアプローチは、P53タンパク質の転写活性を測定するために使用される。しかしながら、酵母S.セレビシエ28およびシゾサッカロマイセスポンベ29における野生型P53の発現は、細胞周期停止28、30またはに関連している成長遅滞を引き起こす可能性がある。細胞死31.いずれの場合も、酵母増殖阻害は高いP53発現によって引き起こされ、細胞増殖に関与する内因性酵母遺伝子の転写変調の可能性と相関している。この仮説を支持して、機能喪失変異体P53 R273Hは、野生型P5332と同様のレベルで発現した場合、酵母細胞の増殖を妨げなかった。逆に、有毒変異体P53V122Aの酵母における発現(野生型P53と比較して転写活性が高いとして知られている)は、野生型P5332よりも強い増殖抑制効果を引き起こした。

さらに、ヒトMDM2が酵母におけるヒトP53転写活性を阻害し、そのユビキチン化およびその後の分解33を促進できることが実証された。従って、ヒトMDM2およびMDMXがP53誘発酵母増殖阻害を阻害する能力が32,34であった。追加の研究では、P53転写活性とアクチン発現レベルとの間に相関が確立され、酵母32におけるACT1遺伝子上流におけるP53 RE上流の同定が確立された。一貫して、アクチン発現は野生型P53によって増強され、さらにP53 V122Aによって強化されたが、変異型P53 R273Hでは増加しなかった。逆に、P53によるアクチン発現は、P53阻害剤MDM2、MDMX、またはピフィトリンα(P53転写活性の低分子阻害剤)の共存在において減少し、酵母増殖アッセイに基づく結果と一致する。重要なことに、これらの結果は、P53誘発成長阻害と酵母におけるその活性の程度との間に相関関係を確立し、P53機能を調節する小分子を同定し、研究することも利用されている28,34,35.

Protocol

1. 特定のRE(yAFM-REまたはyLFM-RE)を含むADE2またはLUC1レポーター酵母株の構築 yAFM-ICOREまたはyLFM-ICORE株12,14(ICORE=I、GAL1プロモーター下でのISce-Iエンドヌクレアーゼ;CO = カウンタ選択可能 URA3 ;RE = レポーター KanMX4カナマイシン耐性を与える;表 1)YPDA寒天プレート上の-80°Cで保存された15%のグリセロール?…

Representative Results

の建設ADE2またはリュック1レポーター酵母株 デリト・ペルフェットアプローチ12、14、15、16は、P53レポーター酵母株の構築を可能にするように適合された(<sup cla…

Discussion

酵母ベースのアッセイは、P53タンパク質機能の様々な側面を調べるのに有用であることが証明されています。これらのアッセイは、機能性多型の評価を含むRE標的部位の変異体に対するP53トランス活性化電位を評価するために特に敏感である。カラーレポーターの使用とルシフェラーゼアッセイの小型化は、費用対効果が高く、比較的スケーラブルなアッセイをもたらす。また、増殖抑制試?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、欧州連合(FEDERファンドPOCI/01/0145/FEDER/007728プログラプラオペラファクターデ・コンペティティビダード-コンペティシダード-コンペティシダード)と国家基金(FCT/MEC、ファンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア、ミニステリオ・ダ・エドゥカサオ・エ・シエンシア)に感謝します。パートナーシップ契約 PT2020 UID/QUI/50006/2019 およびプロジェクト (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 – POCI-01-0145-FEDER-016581。FCTフェローシップ:SFRH/BD/96189/2013(S.ゴメス)この研究は、コンパニア・S・パオロ、トリノ、イタリア(プロジェクト2017.0526)と保健省(プロジェクト5×1000、2015、2016;現在の研究2016)によってサポートされました。テレサ・ロペス=アリアス・モンテネグロ博士(トレント大学実験科学教育研究所)に対し、ビデオ録画の支援に深く感謝します。

Materials

L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500
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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).
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