Summary

Un saggio di citotossicità a base di piastre per la valutazione della funzione citolitica della cellula killer naturale del ratto placentare

Published: June 02, 2019
doi:

Summary

Qui, forniamo una metodologia dettagliata per isolare e valutare la funzione citotossica delle cellule killer naturali da placenta da un saggio di placca colorimetrica. La riduzione della pressione di perfusione uterina modello ratto di ischemia placentare è stato scelto per dimostrare l’isolamento mediato da anticorpi e la valutazione della funzione citotossica delle cellule Natural Killer.

Abstract

È ben noto che le cellule decidue Natural Killer (NK) giocano un ruolo critico nella creazione e nel mantenimento della gravidanza normale. Studi recenti hanno dimostrato una popolazione alterata di cellule NK circolanti e decidue nelle donne che soffrono di complicanze avverse di gravidanza come aborto spontaneo e preeclampsia. Studi del nostro gruppo hanno dimostrato che l’ipertensione in gravidanza è associata ad un aumento della popolazione di cellule NK attivate nella placenta in base all’espressione dei marcatori di attivazione superficiale. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare la funzione citotossica delle cellule NK isolate da placenta in un modello animale di tipo preeclampsia di ischemia placentare indotta chirurgicamente. I seguenti passaggi sono descritti in dettaglio: generazione di sospensione a singola cellula, isolamento delle cellule NK, stimolazione ex vivo, effector: co-coltura cellulare bersaglio e saggio di citotossicità.

Introduction

La preeclampsia è un disturbo ipertensivo della gravidanza caratterizzato da restrizione della crescita fetale, danno dell’organo finale e attivazione immunitaria cronica. L’attivazione immunitaria cronica nelle donne con preeclampsia porta ad un aumento delle citochine infiammatorie circolanti e placentare, uno squilibrio nelle popolazioni di cellule T CD4+ e un aumento della popolazione di cellule di Natural Killer (NK) attivate1. Studi recentemente pubblicati dal nostro laboratorio dimostrano un ruolo per le cellule NK nel causare alcune della fisiopatologia associata alla preeclampsia nel modello ratto di preeclampsia della pressione di perfusione uterina ridotta (RUPP). Utilizzando la citometria a flusso per misurare l’espressione superficiale dei marcatori di attivazione sulle cellule NK, è stata osservata una maggiore popolazione di cellule NK attivate nella circolazione e nelle placenta dei ratti Rupp rispetto ai ratti normali in gravidanza (NP)2.

Per confermare le osservazioni di citometria a flusso, sono stati condotti studi funzionali per valutare l’attività citotossica delle cellule NK isolate dai placenta dei ratti NP e Rupp. Esistono diversi metodi disponibili per la valutazione della funzione citotossica delle cellule T CD8+ citotossiche e delle cellule NK. Lo standard Gold per l’analisi citotossica funzionale è il saggio di rilascio di cromo3. Altri protocolli sviluppati utilizzati includono citometria a flusso4, citometria a immagine5, calceina rilascio6, e più recentemente bioluminescenza7. Questo video fornirà un protocollo dettagliato sull’utilizzo del saggio di rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) ben consolidato per misurare la funzione citotossica delle cellule NK utilizzando un kit di saggio di citotossicità LDH disponibile in commercio.

Protocol

Tutti i protocolli sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali presso l’Università del Mississippi Medical Center. La cura e la manipolazione degli animali erano conformi alle linee guida degli istituti nazionali di sanità per il trattamento etico degli animali. 1. isolamento delle cellule dei linfociti da placentas Rimuovere una placenta dall’utero del ratto (gestazione giorno 19) e mettere in 10 mL di ghiaccio-freddo PBS8</s…

Representative Results

Le cellule NK placentare ottenute da ratti NP e RUPP sono state incubate per 5 ore con cellule bersaglio nei rispettivi media con un rapporto di 50:1 (NK: target). L’assorbanza è stata registrata a 490 nm e i dati grezzi sono mostrati nella tabella 2. Sono stati calcolati l’assorbanza media dello sfondo medio di coltura e dei pozzetti di controllo di correzione del volume. Queste medie sono state sottratte dai pozzi appropriati indicati nel protocollo del fabbricante e sono rappresentate nella t…

Discussion

Ci sono una serie di importanti note chiave da considerare per ottenere risultati ottimali. La sterilità delle cellule utilizzate è molto importante. Dopo la raccolta della placenta, è importante che la preparazione e l’isolamento delle cellule NK siano eseguiti in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza. Inoltre, poiché tutte le cellule rilasciano LDH su danno cellulare, si deve prestare attenzione a ottenere un’elevata vitalità delle cellule NK dopo l’isolamento e durante il processo di co-coltura. Un …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart Lung e Blood Institute degli istituti nazionali di salute sotto sovvenzione R00HL130456, l’Istituto nazionale di scienze mediche generali degli istituti nazionali di salute sotto il premio P20GM104357, e dal Mississippi INBRE, finanziato da un premio di sviluppo istituzionale (IDeA) presso gli istituti nazionali di scienze mediche generali degli istituti nazionali di salute con il numero di sovvenzione P20GM103476. Il contenuto è esclusivamente responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

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Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

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