Summary

הלוח מבוססי ציטורעילות מבוסס על הערכה של עכברוש הרוצח הטבעי בתפקוד התאים Cytolytic

Published: June 02, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת כדי לבודד ולהעריך את הפונקציה ציטוטוקסיות של תאים הרוצח טבעי מפני השמש על ידי שיטת הלוח לצבוע מטרי. הלחץ מופחת זלוף ללחוץ עכברוש מודל של איסכמיה השלתית נבחרה כדי להדגים את הבידוד נוגדן מתווך והערכה של תפקוד ציטוטוקסיים של תאים הרוצח הטבעי.

Abstract

ידוע היטב כי הרוצח טבעי הדציבלים (NK) תאים לשחק תפקיד קריטי בהקמת ותחזוקה של הריון רגיל. מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו אוכלוסייה שונה של במחזור והשמדת התאים NK כפול אצל נשים הסובלות סיבוכים הריון שלילית כגון הפלה חוזרות ו טרום הרעלת. מחקרים של הקבוצה שלנו הראו כי יתר לחץ דם בהריון קשורה לאוכלוסיה מוגברת של תאי NK מופעל השליה מבוסס על הביטוי של סמנים הפעלת פני השטח. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט כדי להעריך את הפונקציה ציטוטוקסיות של תאי NK מבודדים מפלנטכמו במודל בעלי חיים כמו הרעלת-הזרע של איסכמיה הנגרמת בניתוח. השלבים הבאים מתוארים בפירוט: דור של השעיה תא יחיד, בידוד תא NK, גירוי vivo ex, אפקטור: תא היעד המשותף התרבות, ואת שיטת הרעילות.

Introduction

Preאקלמפסיה היא הפרעה יתר לחץ דם של ההריון מאופיין הגבלת צמיחה עוברית, לסיים איבר נזק הפעלה חיסונית כרונית. הפעלה חיסונית כרונית אצל נשים עם טרום האקלמפסיה מוביל במחזור מוגבר ציטוקינים דלקתיים בנטל, חוסר איזון ב CD4+ T תאים אוכלוסיות, ו מוגברת האוכלוסייה של הרוצח הטבעי המופעל (NK) תאים1. מחקרים שפורסמו לאחרונה על ידי המעבדה שלנו להפגין תפקיד עבור תאים NK בגרימת כמה הפתופסולוגיה הקשורים טרום אקלמפסיה בלחץ רחמי Perfusion (ראפ) מודל החולדה של טרום הרעלת הרחם. באמצעות הזרמת cy, למדוד ביטוי פני השטח של סמנים הפעלה על תאים NK, האוכלוסייה מוגברת של תאים NK מופעל במחזור והפלנטאס של חולדות ראפ לעומת נורמלי בהריון (NP) חולדות נצפתה2.

כדי לאשר את הזרם cy, לבחון את התצפיות, מחקרים פונקציונליים כדי להעריך את הפעילות ציטוטוקסיטים של תאים NK מבודדים מן הפלנטאס של NP וחולדות ראפ בוצעו. ישנן מספר שיטות זמין להערכת תפקוד ציטוטוקסיים של תאים CD8- T ציטוטוקסיים ותאים NK. התקן הזהב עבור ניתוח ציטוטוקסיים פונקציונלי הוא שחרור כרום שיטת3. פרוטוקולים מפותחים אחרים מנוצל כוללים הזרימה cy, לנסות4, התמונה cy, לנסות5, calcein שחרור6, ולאחרונה ביולומינסנציה7. וידאו זה יספק פרוטוקול מפורט על שימוש היטב מבוססת לקטט דהידרוגנאז (ldh) שחרור התפקוד למדוד פונקציה ציטוטוקסיים של תאים NK באמצעות ערכה מסחרית של ldh הרעילות ציטובית.

Protocol

כל הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש במרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי. הטיפול והטיפול של בעלי החיים היו בהסכמה עם המוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול מוסרי בעלי חיים. 1. תא לימפוציט בידוד מפלנטאס הסר שליה אחת מן הרחם עכברוש (יום הה?…

Representative Results

שלנטל התאים שהתקבלו מ NP ו רופ חולדות היו מודבטים עבור 5 h עם תאים היעד ב דיות המתאימים שלהם ביחס של 50:1 (NK: היעד). הקליטה הוקלטה ב490 ננומטר והנתונים הגולמיים מוצגים בטבלה 2. הספיגה הממוצעת של רקע התרבות ובארות השליטה בתיקון אמצעי האחסון חושבו. ממוצעים אלה המופגו מבארות המתאימות המסומנ?…

Discussion

קיימים מספר הערות חשובות שכדאי לשקול לקבלת תוצאות אופטימליות. עקרות התאים מנוצל חשוב מאוד. לאחר אוסף של השליה, חשוב כי הכנה ובידוד של התאים NK מתבצעים בתנאים סטרילי בארון בטיחות ביולוגית. יתר על כן, כי כל התאים לשחרר LDH על הנזק התאי, יש לנקוט כדי להשיג כדאיות גבוהה של תאים NK לאחר בידוד במהלך ת?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה הזאת נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות ובדם של המוסדות הלאומיים של בריאות תחת גרנט R00HL130456, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס P20GM104357, ועל ידי מיסיסיפי INBRE, ממומן על ידי פרס פיתוח מוסדי (רעיון) מן המוסדות הלאומיים של מדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר P20GM103476. התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

Play Video

Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

View Video