Summary

Ein platebasierter Cytotoxicity Assay zur Bewertung der Rate Placental Natural Killer Cell Cytolytic Funktion

Published: June 02, 2019
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Summary

Hier stellen wir eine detaillierte Methodik zur Verfügung, um die zytotoxische Funktion natürlicher Killerzellen von den Plazenta durch einen farbimetrischen Plattentat zu isolieren und zu bewerten. Das reduzierte Mutterperfusionsdruckrattenmodell der Plazenta-Ischämie wurde ausgewählt, um die antikörpervermittelte Isolierung und Beurteilung der zytotoxischen Funktion natürlicher Killerzellen zu demonstrieren.

Abstract

Es ist allgemein bekannt, dass dezidale Naturkiller (NK) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung der normalen Schwangerschaft spielen. Neuere Studien haben gezeigt, dass sich bei Frauen, die an negativen Schwangerschaftskomplikationen wie wiederkehrenden Fehlgeburten und Präeklampsie leiden, eine veränderte Population von zirkulierenden und dezidalen NK-Zellen verändert. Studien unserer Gruppe haben gezeigt, dass Bluthochdruck in der Schwangerschaft mit einer erhöhten Population von aktivierten NK-Zellen in der Plazenta auf der Grundlage der Expression von Oberflächenaktivierungsmarkern verbunden ist. Dieses Manuskript liefert ein detailliertes Protokoll, um die zytotoxische Funktion von NK-Zellen zu beurteilen, die von Placentas in einem präeklampsia-ähnlichen Tiermodell der chirurgisch induzierten Plazentämie isoliert sind. Die folgenden Schritte werden detailliert beschrieben: Generierung von Einzelzellenaufhängung, NK-Zell-Isolierung, Ex-vivo-Stimulation, Effektor: Zielzellenkultur und der Zytotoxizitäts-Test.

Introduction

Die Präeklampsie ist eine hypertensive Störung der Schwangerschaft, die durch fetale Wachstumseinschränkung, End-Organschäden und chronische Immunaktivierung gekennzeichnet ist. Die chronische Immunaktivierung bei Frauen mit Präeklampsie führt zu vermehrten zirkulierenden und plazentalen entzündlichen Zytokinen, einem Ungleichgewicht in CD4+ T-Zellen-Populationen und einer erhöhten Population vonaktivierten Naturkillerzellen (NK) 1. Studien, die kürzlich in unserem Labor veröffentlicht wurden, zeigen eine Rolle für NK-Zellen bei der Entstehung einiger der Pathophysiologie, die mit Präeklampsie im Rattenmodell “Reduced UUPP” (RUPP) der Präeklampsie in Verbindung gebracht wird. Mit Hilfe der Strömungszytometrie wurde eine erhöhte Population von aktivierten NK-Zellen im Kreislauf und Placentas von RUPP-Ratten im Vergleich zu normalen schwangeren (NP) Ratten beobachtet.

Um die Strömungszytometrie-Beobachtungen zu bestätigen, wurden funktionelle Studien durchgeführt, um die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen zu beurteilen, die von den Plazenta von NP und RUPP-Ratten isoliert wurden. Es gibt mehrere Methoden zur Beurteilung der zytotoxischen Funktion von zytotoxischen CD8+ T-Zellen und NK-Zellen. Der Goldstandard für die funktionelle zytotoxische Analyse ist der Chrom-Release-Test3. Weitere entwickelte Protokolle,die verwendet werden, sind die Fließzytometrie 4, die Bildcytometrie 5, die Kalkein-Version6und zuletzt die Biolumineszenz7. Dieses Video wird ein detailliertes Protokoll über die Verwendung des gut etablierten Laktat-Dehydrierungs-Tests (LDH) zur Messung der zytotoxischen Funktion von NK-Zellen mit einem kommerziell erhältlichen LDH-Zytotoxizitäts-Assay-Kit liefern.

Protocol

Alle Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Mississippi Medical Center genehmigt. Die Pflege und der Umgang mit den Tieren entsprachen den Nationalen Gesundheitsrichtlinien für die ethische Tierbehandlung. 1. Lymphozyte Cell Isolation von Placentas Entfernen Sie eine Plazenta aus der Ratte Gebärmutter (Gestation Tag 19) und legen Sie in 10 mL eiskalte PBS8. Legen Sie eine Plazenta auf einen 100 μm-Filte…

Representative Results

Die von NP-und RUPP-Ratten gewonnenen transzentalen NK-Zellen wurden für 5 Stunden mit Zielzellen in ihren jeweiligen Medien im Verhältnis 50 (NK: Ziel) inkubiert. Absorbance wurde mit 490 nm aufgezeichnet und die Rohdaten werden in Tabelle 2angezeigt. Die durchschnittliche Absorption des Kulturmittel-Rückgrundes und der Volumenkorrektur der Kontrollbrunnen wurde berechnet. Diese Durchschnittswerte wurden von den entsprechenden Brunnen abgezogen, die im Herstellerprotokoll angegeben sind und sind in <…

Discussion

Es gibt eine Reihe wichtiger Schlüsselangaben, die für optimale Ergebnisse zu berücksichtigen sind. Die Sterilität der verwendeten Zellen ist sehr wichtig. Nach der Sammlung der Plazenta ist es wichtig, dass die Vorbereitung und Isolierung der NK-Zellen unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt wird. Da alle Zellen LDH bei Zellschäden freisetzen, sollte man außerdem darauf achten, dass die NK-Zellen nach der Isolation und während des Ko-Kulturprozesses eine hohe Lebensfähigkeit der N…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Heart Lung and Blood Institute der National Institutes of Health im Rahmen des Stipendiums R00HL130456, dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter dem Preis P20GM104357, und von der Mississippi INBRE, finanziert durch einen Institutional Development Award (IDeA) von den National Institutes of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM103476. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und vertritt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der Nationalen Gesundheitsinstitute.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

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Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

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