Summary

Un dosage de cytotoxicité à base de plaques pour l’évaluation de la fonction cytolytique des cellules tueuses naturelles du rat placentaire

Published: June 02, 2019
doi:

Summary

Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée pour isoler et évaluer la fonction cytotoxique des cellules tueuses naturelles de placentas par un dosage de la plaque colorimétrique. Le modèle de rat à pression de perfusion utérine réduit de l’ischémie placentaire a été choisi pour démontrer l’isolement et l’évaluation par médiation des anticorps de la fonction cytotoxique des cellules tueuses naturelles.

Abstract

Il est bien connu que les cellules du tueur naturel (NK) déciduelles jouent un rôle crucial dans l’établissement et le maintien d’une grossesse normale. Des études récentes ont montré une population altérée de cellules NK circulantes et décibiales chez les femmes qui souffrent de complications de grossesse défavorables telles que la fausse couche récurrente et la prééclampsie. Des études de notre groupe ont montré que l’hypertension dans la grossesse est associée à une population accrue de cellules NK activées dans le placenta en fonction de l’expression des marqueurs d’activation de surface. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour évaluer la fonction cytotoxique des cellules NK isolées des placentas dans un modèle animal de type prééclampsie d’ischémie placentaire induite chirurgicalement. Les étapes suivantes sont décrites en détail: génération de suspension à cellule unique, isolement cellulaire NK, stimulation ex vivo, effecteur: co-culture des cellules cibles et dosage de la cytotoxicité.

Introduction

La prééclampsie est un trouble hypertensif de la grossesse caractérisé par la restriction de croissance fœtale, les lésions des organes finaux et l’activation immunitaire chronique. L’activation immunitaire chronique chez les femmes atteintes de prééclampsie conduit à une augmentation de la circulation et des cytokines inflammatoires placentaires, un déséquilibre dans les cellules CD4+ T populations, et une population accrue de cellules de tueur naturel (NK) activées1. Les études récemment publiées par notre laboratoire démontrent un rôle pour les cellules NK en provoquant une partie de la pathophysiologie associée à la prééclampsie dans le modèle de rat de prééclampsie de la pression de perfusion utérine réduite (RUPP). En utilisant la cytométrie en flux pour mesurer l’expression de la surface des marqueurs d’activation sur les cellules NK, on a observé une augmentation de la population des cellules NK activées dans la circulation et les placentas des rats RUPP comparativement aux rats normaux gravides (NP)2.

Pour confirmer les observations de cytométrie en flux, des études fonctionnelles pour évaluer l’activité cytotoxique des cellules NK isolées des placentas des rats NP et RUPP ont été effectuées. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour l’évaluation de la fonction cytotoxique des cellules cytotoxiques de l+ T et des cellules NK. La norme d’or pour l’analyse cytotoxique fonctionnelle est le test de libération du chrome3. D’autres protocoles développés utilisés incluent cytométrie en flux4, cytométrie d’image5, calcéine Release6, et plus récemment bioluminescence7. Cette vidéo fournira un protocole détaillé sur l’utilisation du dosage bien établi de la lactate déshydrogénase (LDH) pour mesurer la fonction cytotoxique des cellules NK à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité LDH disponible dans le commerce.

Protocol

Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université du Mississippi. Les soins et la manipulation des animaux étaient conformes aux directives des instituts nationaux de la santé pour le traitement éthique des animaux. 1. isolement des cellules lymphocytes des placentas Retirer un placenta de l’utérus du rat (jour de gestation 19) et le placer dans 10 mL de PBS8</su…

Representative Results

Les cellules NK placentaires obtenues à partir de rats NP et RUPP ont été incubées pendant 5 h avec des cellules cibles dans leurs médias respectifs, à un ratio de 50:1 (NK: target). L’absorbance a été enregistrée à 490 nm et les données brutes sont indiquées dans le tableau 2. On a calculé l’absorbance moyenne du fond de milieu de culture et des puits de contrôle de correction de volume. Ces moyennes ont été soustraites des puits appropriés indiqués dans le protocole du fabricant e…

Discussion

Il y a un certain nombre de notes clés importantes à considérer pour des résultats optimaux. La stérilité des cellules utilisées est très importante. Après la collecte du placenta, il est important que la préparation et l’isolement des cellules NK soient effectuées dans des conditions stériles dans un cabinet de biosécurité. En outre, parce que toutes les cellules libèrent LDH sur les dommages cellulaires, il faut prendre soin d’obtenir une grande viabilité des cellules NK après l’isolement et Pend…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été appuyé par l’Institut national de cardiopathie et de sang des instituts nationaux de la santé sous la subvention R00HL130456, l’Institut national des sciences médicales générales des instituts nationaux de la santé sous le prix P20GM104357, et par le Mississippi INBRE, financé par un prix de développement institutionnel (IDeA) des instituts nationaux de sciences médicales générales des instituts nationaux de la santé sous le numéro de subvention P20GM103476. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

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Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

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