Burada sunulan yöntemin amacı, mikroortam mikrodiziler (Mema) nasıl imal edilebilir ve kültürlü hücrelerin fenotürü üzerinde basit Kombinatoryal mikroortamlar binlerce etkisini sorgulamak için kullanılan göstermek için.
Mikroortamın hücrelerin phenoype üzerindeki etkisini anlamak, hem çözünür büyüme faktörleri hem de mikro ortamda matris ilişkili proteinlerin kompleks karışımı nedeniyle zor bir sorundur. Ayrıca, mikroortamlar içinde vitro modelleme için kolayca kullanılabilir reaktifler genellikle tamamen tanımlanmış ve toplu değişkenlik için toplu muzdarip proteinlerin karmaşık karışımları kullanın. Mikro Mikroarray (Mema) platformu tek bir tahlil içinde hücresel fenotipleri üzerindeki etkileri için mikro çevre proteinleri binlerce basit kombinasyonları değerlendirilmesi için izin verir. Memalar, bireysel liglerin dizilmiş ekstrenüler matris (ECM) proteinlerini içeren ayrı kuyulara eklenmesini sağlayan iyi plakalar halinde hazırlanmaktadır. Her basılı ECM ile çözünür ligand kombinasyonu benzersiz bir kombinasyon oluşturur. Tipik bir Mema tahlil hücre tek bir tahlil maruz kalan 2.500 benzersiz Kombinatoryal mikroortamlar büyük içerir. Bir test durumu olarak, meme kanseri hücre hattı MCF7 MEMA platformunda kaplama oldu. Bu tahlil Analizi hem geliştirmek ve bu hücrelerin büyümesi ve proliferasyonu inhibe faktörler tespit. MEMA platformu son derece esnektir ve kanser araştırmalarının ötesinde diğer biyolojik sorularla kullanılmak üzere uzatılabilir.
İki boyutlu (2D) monolayers plastik üzerinde kanser hücre hatları kültür kanser araştırmacıları için büyük workhorses vardır biri kalır. Ancak, mikroortam giderek hücresel fenotürleri etkisi yeteneği için tanınıyor. Kanserde, tümör mikroçevre, büyüme, hayatta kalma, invazyon ve tedaviye yanıt dahil olmak üzere birden fazla hücresel davranışları etkileyen bilinmektedir1,2. Geleneksel Tek tabakalı hücre kültürler genellikle mikroçevre etkileri eksikliği, hangi daha karmaşık üç boyutlu gelişimine yol açmıştır (3D) hücreleri büyümek için tespit, ticari olarak kullanılabilir arıtılmış Bodrum membran özler de dahil olmak üzere. Ancak, bu saflaştırılmış matrisler genellikle kullanmak ve toplu değişkenlik3 ve karmaşık kompozisyonlar3gibi teknik sorunlardan muzdarip karmaşıklaşır. Sonuç olarak, hücresel fenotürleri etkileyen olabilir belirli proteinler için fonksiyon atamak zor olabilir3.
Bu sınırlamaları gidermek için, mikroortam Mikroarray (Mema) teknolojisini geliştirdik, bu da mikro ‘ı basit bileşimsiz matris (ECM) ve çözünebilir büyüme faktörü proteinlerinin kolay kombinasyonuna düşüren4,5 . MEMA platformu, hücrelerin davranışını etkileyen baskın mikroçevresel faktörlerin tanımlanması sağlar. Bir dizi biçimi kullanarak, mikro ortam faktörlerinin kombinasyonları binlerce tek bir denemede farklı teknik kullanılarak olabilir. MEMA burada açıklanan interrogates ~ 2.500 farklı benzersiz mikroçevre koşulları. İyi plakalara yazdırılan ECM proteinleri, hücrelerin kültürlü olması üzerine büyüme pedleri oluşturur. Çözünür ligler bireysel kuyulara eklenir, hücrelerin maruz kaldığı her farklı noktada benzersiz Kombinatoryal mikroortamlar (ECM + ligand) oluşturma. Hücreler birkaç gün boyunca kültürlü, sonra sabit, lekeli, ve bu özel mikroçevre kombinasyonları maruz kalma sonucu hücresel fenotipleri değerlendirmek için görüntülenmiştir. Mikroortamlar basit kombinasyonları olduğundan, hücrelerde büyük fenotipi değişiklikler yapan proteinlerin tanımlanması basittir. Memalar, hücre kaderi kararları ve terapi4,5,6,7tepki sürücü olanlar da dahil olmak üzere, birden fazla hücresel fenotürleri etkileyen faktörleri belirlemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu tepkiler basit 2D deneylerde doğrulanabilir ve daha sonra tümör mikroortamının karmaşıklığını daha tam olarak tekrar eden koşullar altında değerlendirilebilir. MEMA platformu, iyi fenotip biyomarkerlerin mevcut olması koşuluyla, çeşitli hücre türleri ve uç noktalarıyla oldukça uyarlanabilir.
“Dimensionality” ve içeriğin önemi, mikroçevre11ile etkileşimi ile kanser hücrelerinin karakterizasyonu araçları olarak in vitro kültür sistemlerinin geliştirilmesi konusunda motive edici bir faktör olmuştur ve in vitro yeteneği Kültür sistemleri in vivo çevre taklit etmek için bu kültür sistemleri geliştirmek için arayışı arkasında bir itici kuvvettir. In vitro sistemlerde, ancak, oldukça basitleştirilmiş bir model12aşağı kompleks in vivo du…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, ağ hücresel Imzaları (LıNCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H. ve J. E. K) NıH ortak fon Kütüphanesi tarafından destekleniyordu.
Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Triton X100 | Sigma | T9284 | |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
BSA | Fisher | BP-1600 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |