Summary

Utilizzo di microarray per interrogare l'impatto microambientale sui fenotipi cellulari nel cancro

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

Lo scopo del metodo qui presentato è quello di mostrare come i microarray di microambiente (MEMA) possono essere fabbricati e utilizzati per interrogare l’impatto di migliaia di semplici microambienti combinatori sul fenotipo delle cellule coltivate.

Abstract

Comprendere l’impatto del microambiente sul fenotipo delle cellule è un problema difficile dovuto alla complessa miscela di fattori di crescita solubili e proteine associate a matrici nel microambiente in vivo. Inoltre, i reagenti prontamente disponibili per la modellazione di microambienti in vitro in genere utilizzano complesse miscele di proteine che sono incompletamente definite e soffrono di variabilità in lotti. La piattaforma microarray microambiente (MEMA) consente la valutazione di migliaia di semplici combinazioni di proteine microambientali per il loro impatto sui fenotipi cellulari in un unico test. I MEMA sono preparati in piastre di pozzo, che consente l’aggiunta di singoli ligandri per separare pozzi contenenti proteine a matrice extracellulare (ECM) suddivise. La combinazione del ligando solubile con ogni ECM stampato forma una combinazione unica. Un tipico test MEMA contiene più di 2.500 microambienti combinatori unici a cui le cellule sono esposte in un unico test. Come test case, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata placcata sulla piattaforma MEMA. L’analisi di questo analisi ha identificato i fattori che migliorano e inibiscono la crescita e la proliferazione di queste cellule. La piattaforma MEMA è altamente flessibile e può essere estesa per l’uso con altre questioni biologiche al di là della ricerca sul cancro.

Introduction

La raccolta di linee cellulari tumorali su plastica in monostrati bidimensionali (2D) rimane uno dei principali cavalli di battaglia per i ricercatori oncologici. Tuttavia, il microambiente è sempre più riconosciuto per la sua capacità di impatto sui fenotipi cellulari. Nel cancro, il microambiente tumorale è noto per influenzare più comportamenti cellulari, tra cui la crescita, sopravvivenza, invasione, e la risposta alla terapia1,2. Le colture cellulari monostratore tradizionali in genere mancano di influenze microambientali, il che ha portato allo sviluppo di analisi tridimensionali più complesse (3D) per far crescere le cellule, compresi gli estratti di membrana seminterrato purificati disponibili in commercio. Tuttavia, queste matrici purificate sono in genere complicate da usare e soffrono di problemi tecnici come la variabilità del lotto3 e le composizioni complesse3. Di conseguenza, può essere difficile assegnare la funzione a specifiche proteine che possono avere un impatto sui fenotipi cellulari3.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato la tecnologia microarray microambiente (MEMA), che riduce il microambiente fino a semplici combinazioni di matrice extracellulare (ECM) e proteine solubili del fattore di crescita4,5 . La piattaforma MEMA consente l’identificazione di fattori microambientali dominanti che influenzano il comportamento delle cellule. Utilizzando un formato di matrice, migliaia di combinazioni di fattori di microambiente possono essere tese in un unico esperimento. La MEMA qui descritta interroga 2.500 diverse condizioni di microambiente unico. Le proteine ECM stampate in lastre di pozzo formano pastiglie di crescita su cui le cellule possono essere coltivate. I ligandi solubili vengono aggiunti ai singoli pozzi, creando microambienti combinatori unici (ECM e ligando) su ogni punto diverso a cui sono esposte le cellule. Le cellule vengono coltivate per diversi giorni, quindi fisse, colorate e imagete per valutare i fenotipi cellulari come risultato dell’esposizione a queste specifiche combinazioni di microambienti. Poiché i microambienti sono semplici combinazioni, è semplice identificare le proteine che guidano i principali cambiamenti fenotipici nelle cellule. I MEMA sono stati utilizzati con successo per identificare i fattori che influenzano più fenotipi cellulari, compresi quelli che guidano le decisioni del destino cellulare e la risposta alla terapia4 ,5,6,7. Queste risposte possono essere convalidate in semplici esperimenti 2D e possono quindi essere valutate in condizioni che riassumono più pienamente la complessità del microambiente tumorale. La piattaforma MEMA è altamente adattabile a una varietà di tipi di cellule ed endpoint, a condizione che siano disponibili buoni biomarcatori fenotipici.

Protocol

NOT:</ Una panoramica dell’intero processo MEMA, incluso il tempo stimato, è descritta nel diagramma di flusso illustrato nella Figura 1. Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di MEMA in lastre a 8 pozze. Il protocollo può essere adattato per altre piastre o diapositive. 1. Preparazione di buffer proteici, diluenti e coloranti Fiale di ECMs Equilibrat ligando, e citochine a temperatura ambiente (RT) e centrifug…

Representative Results

Per semplificare gli impatti microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule e per identificare le condizioni che hanno promosso o inibito la crescita e la proliferazione cellulare, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata seminata su una serie di otto MEMA con 8 carri come descritto nel protocollo. Questo test ha esposto le cellule a 48 diversi EPER e 57 diversi ligandi, per un totale di 2736 condizioni microambientali combinatori. Dopo 71 h in coltura, le cellule sono state pulsate con EdU, …

Discussion

L’importanza della “dimensionalità” e del contesto è stata un fattore motivante nello sviluppo di sistemi di coltura in vitro come strumenti nella caratterizzazione delle cellule tumorali attraverso la loro interazione con il microambiente11,e la capacità di in vitro sistemi di coltura per imitare l’ambiente in vivo è una forza trainante dietro la ricerca di migliorare quei sistemi di coltura. I sistemi in vitro, tuttavia, rimangono strumenti significativi di ricerca sul cancro proprio a causa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione HG008100 (J.W.G., L.M.H.) niH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS).

Materials

Aushon 2470 Aushon BioSystems Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA Nikon High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler BioTek liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution Sigma T2069
EDTA Invitrogen 15575-038
Glycerol Sigma G5516
Triton X100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P7949
Kolliphor P338 BASF 50424591
384-well microarray plate, cylindrical well Thermo Fisher ab1055
Nunc 8 well dish Thermo Fisher 267062
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Science 15710
BSA Fisher BP-1600
Sodium Azide Sigma S2002
Cell Mask Molecular Probes H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor Molecular Probes C10357
DAPI Promo Kine PK-CA70740043
ALCAM R & D Systems 656-AL ECM
Cadherin-20 (CDH20) R & D Systems 5604-CA ECM
Cadherin-6 (CDH6) R & D Systems 2715-CA ECM
Cadherin-8 (CDH8) R & D Systems 188-C8 ECM
CD44 R & D Systems 3660-CD ECM
CEACAM6 R & D Systems 3934-CM ECM
Collagen I Cultrex 3442-050-01 ECM
Collagen Type II Millipore CC052 ECM
Collagen Type III Millipore CC054 ECM
Collagen Type IV Sigma C5533 ECM
Collagen Type V Millipore CC077 ECM
COL23A1 R & D Systems 4165-CL ECM
Desmoglein 2 R & D Systems 947-DM ECM
E-cadherin (CDH1) R & D Systems 648-EC ECM
ECM1 R & D Systems 3937-EC ECM
Fibronectin R & D Systems 1918-FN ECM
GAP43 Abcam ab114188 ECM
HyA-500K R & D Systems GLR002 ECM
HyA-50K R & D Systems GLR001 ECM
ICAM-1 R & D Systems 720-IC ECM
Laminin Sigma L6274 ECM
Laminin-5 Abcam ab42326 ECM
Lumican R & D Systems 2846-LU ECM
M-Cad (CDH15) R & D Systems 4096-MC ECM
Nidogen-1 R & D Systems 2570-ND ECM
Osteoadherin/OSAD R & D Systems 2884-AD ECM
Osteopontin (SPP) R & D Systems 1433-OP ECM
P-Cadherin (CDH3) R & D Systems 861-PC ECM
PECAM1 R & D Systems ADP6 ECM
Tenascin C R & D Systems 3358-TC ECM
VCAM1 R & D Systems ADP5 ECM
vitronectin R & D Systems 2308-VN ECM
Biglycan R & D Systems 2667-CM ECM
Decorin R & D Systems 143-DE ECM
Periostin R & D Systems 3548-F2 ECM
SPARC/osteonectin R & D Systems 941-SP ECM
Thrombospondin-1/2 R & D Systems 3074-TH ECM
Brevican R & D Systems 4009-BC ECM
Elastin BioMatrix 5052 ECM
Fibrillin Lynn Sakai Lab OHSU N/A ECM
ANGPT2 RnD_Systems_Own 623-AN-025 Ligand
IL1B RnD_Systems_Own 201-LB-005 Ligand
CXCL8 RnD_Systems_Own 208-IL-010 Ligand
IGF1 RnD_Systems_Own 291-G1-200 Ligand
TNFRSF11B RnD_Systems_Own 185-OS Ligand
BMP6 RnD_Systems_Own 507-BP-020 Ligand
FLT3LG RnD_Systems_Own 308-FK-005 Ligand
CXCL1 RnD_Systems_Own 275-GR-010 Ligand
DLL4 RnD_Systems_Own 1506-D4-050 Ligand
HGF RnD_Systems_Own 294-HGN-005 Ligand
Wnt5a RnD_Systems_Own 645-WN-010 Ligand
CTGF Life_Technologies_Own PHG0286 Ligand
LEP RnD_Systems_Own 398-LP-01M Ligand
FGF2 Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG Ligand
FGF6 RnD_Systems_Own 238-F6 Ligand
IL7 RnD_Systems_Own 207-IL-005 Ligand
TGFB1 RnD_Systems_Own 246-LP-025 Ligand
PDGFB RnD_Systems_Own 220-BB-010 Ligand
WNT10A Genemed_Own 90009 Ligand
PTN RnD_Systems_Own 252-PL-050 Ligand
BMP3 RnD_Systems_Own 113-BP-100 Ligand
BMP4 RnD_Systems_Own 314-BP-010 Ligand
TNFSF11 RnD_Systems_Own 390-TN-010 Ligand
CSF2 RnD_Systems_Own 215-GM-010 Ligand
BMP5 RnD_Systems_Own 615-BMC-020 Ligand
DLL1 RnD_Systems_Own 1818-DL-050 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 296-HR-050 Ligand
KNG1 RnD_Systems_Own 1569-PI-010 Ligand
GPNMB RnD_Systems_Own 2550-AC-050 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 350-NS-010 Ligand
IL15 RnD_Systems_Own 247-ILB-005 Ligand
TNF RnD_Systems_Own 210-TA-020 Ligand
IGFBP3 RnD_Systems_Own 675-B3-025 Ligand
WNT3A RnD_Systems_Own 5036-WNP-010 Ligand
PDGFAB RnD_Systems_Own 222-AB Ligand
AREG RnD_Systems_Own 262-AR-100 Ligand
JAG1 RnD_Systems_Own 1277-JG-050 Ligand
BMP7 RnD_Systems_Own 354-BP-010 Ligand
TGFB2 RnD_Systems_Own 302-B2-010 Ligand
VEGFA RnD_Systems_Own 293-VE-010 Ligand
IL6 RnD_Systems_Own 206-IL-010 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 351-FS-010 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 378-SM Ligand
IGFBP2 RnD_Systems_Own 674-B2-025 Ligand
SHH RnD_Systems_Own 1314-SH-025 Ligand
FASLG RnD_Systems_Own 126-FL-010 Ligand

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Cite This Article
Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D., Gross, S., Sudar, D., Bucher, E., Nederlof, M., Dane, M., Gray, J. W., Heiser, L., Korkola, J. E. Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer. J. Vis. Exp. (147), e58957, doi:10.3791/58957 (2019).

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