O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.
Compreender o impacto do microambiente no fenótipo das células é um problema difícil devido à complexa mistura de fatores de crescimento solúvel e proteínas associadas à matriz no microambiente in vivo. Além disso, os reagentes prontamente disponíveis para a modelagem de microambientes in vitro utilizam tipicamente misturas complexas das proteínas que são definidas incompletamente e sofrem da variabilidade do grupo à lote. A plataforma do microarray do microambiente (Mema) permite a avaliação de milhares de combinações simples de proteínas do microambiente para seu impacto em fenótipos celulares em um único ensaio. Os MEMAs são preparados em placas de poço, o que permite a adição de ligantes individuais para separar os poços contendo proteínas de matriz extracelular (ECM) dispostas. A combinação do ligante solúvel com cada ECM impresso dá forma a uma combinação original. Um ensaio típico MEMA contém mais de 2.500 microambientes combinatórios únicos que as células são expostas em um único ensaio. Como um caso de teste, a linha celular MCF7 do cancro da mama foi chapeada na plataforma de MEMA. A análise deste ensaio identificou fatores que aumentam e inibem o crescimento e a proliferação dessas células. A plataforma MEMA é altamente flexível e pode ser estendida para uso com outras questões biológicas além da pesquisa de câncer.
A cultura de linhagens de células cancerosas em plástico em monocamadas bidimensional (2D) continua sendo um dos principais cavalos de trabalho para pesquisadores de câncer. No entanto, o microambiente está sendo cada vez mais reconhecido por sua capacidade de impactar os fenótipos celulares. No câncer, o microambiente tumoral é conhecido por influenciar múltiplos comportamentos celulares, incluindo crescimento, sobrevida, invasão e resposta à terapia1,2. As culturas tradicionais da pilha do monocamada faltam tipicamente influências do microambiente, que conduziu ao desenvolvimento de uns ensaios tridimensionais (3D) mais complexos para crescer pilhas, incluindo extratos purificados comercialmente disponíveis da membrana do porão. No entanto, essas matrizes purificadas são tipicamente complicadas de usar e sofrem de problemas técnicos, como a variabilidade do lote3 e composições complexas3. Como resultado, pode ser difícil atribuir a função a proteínas específicas que podem estar afetando os fenótipos celulares3.
Para abordar essas limitações, desenvolvemos a tecnologia microarray (Mema), que reduz o microambiente até combinações simples de matriz extracelular (ECM) e proteínas de fator de crescimento solúvel4,5 . A plataforma MEMA possibilita a identificação de fatores microambientais dominantes que impactam o comportamento das células. Usando um formato de matriz, milhares de combinações de fatores de microambiente podem ser testadas em um único experimento. O MEMA descrito aqui interroates ~ 2.500 diferentes condições únicas de microambiente. As proteínas ECM impressas em placas de poço formam almofadas de crescimento sobre as quais as células podem ser cultivadas. Os ligantes solúveis são adicionados aos poços individuais, criando os microambientes combinatória originais (ECM + ligand) em cada ponto diferente a que as pilhas são expostas. As células são cultivadas por vários dias, em seguida, fixo, manchado, e imaged para avaliar fenótipos celulares como resultado da exposição a estas combinações específicas de microambiente. Desde que os microambientes são combinações simples, é direto identificar as proteínas que conduzem mudanças fenotípicas principais nas pilhas. As memas têm sido utilizadas com sucesso para identificar fatores que influenciam vários fenótipos celulares, incluindo aqueles que impulsionam as decisões de destino da célula e a resposta à terapia4,5,6,7. Essas respostas podem ser validadas em experimentos 2D simples e, em seguida, podem ser avaliadas em condições que recapitulam mais plenamente a complexidade do microambiente tumoral. A plataforma MEMA é altamente adaptável a uma variedade de tipos de células e endpoints, desde que estejam disponíveis bons biomarcadores fenotípicos.
A importância da “dimensionalidade” e do contexto tem sido um fator motivador no desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro como ferramentas na caracterização de células cancerosas através de sua interação com o microambiente11, e a capacidade de in vitro sistemas de cultura para imitar o ambiente in vivo é uma força motriz por trás da busca para melhorar esses sistemas de cultura. No entanto, os sistemas in vitro continuam a ser instrumentos significativos de investigação do canc…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela biblioteca de fundos comuns da NIH de assinaturas de rede celular (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., e J. E. K).
Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Triton X100 | Sigma | T9284 | |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
BSA | Fisher | BP-1600 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |