Summary

استخدام المصفوفات الدقيقة لاستجواب الأثر البيئي الدقيق على الأنماط الظاهرية الخلوية في السرطان

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

الغرض من الطريقة المعروضة هنا هو إظهار كيف يمكن تصنيع النُفَج ّة الدقيقة للبيئة الدقيقة (MEMA) واستخدامها لاستجواب تأثير آلاف البيئات الدقيقة المؤتلفة البسيطة على النمط الظاهري للخلايا المستزرعة.

Abstract

فهم تأثير البيئة الدقيقة على النمط الظاهري للخلايا مشكلة صعبة بسبب الخليط المعقد من كل من عوامل النمو القابلة للذوبان والبروتينات المرتبطة بالمصفوفة في البيئة الدقيقة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن الكواشف المتاحة بسهولة لنمذجة البيئات الدقيقة في المختبر تستخدم عادة خليطا معقدا من البروتينات التي يتم تعريفها بشكل غير كامل وتعاني من تقلب الدفعة إلى الدفعية. تسمح منصة microarray microenvironment (MEMA) بتقييم الآلاف من التركيبات البسيطة من بروتينات البيئة الدقيقة لتأثيرها على الأنماط الظاهرية الخلوية في اختبار واحد. يتم إعداد MEMAs في لوحات جيدا، والذي يسمح بإضافة الأربطة الفردية لفصل الآبار التي تحتوي على مصفوفة مصفوفة مصفوفة مصفوفة مصفوفة (ECM) البروتينات. مزيج من الرباط القابلة للذوبان مع كل ECM المطبوعة تشكل مزيجا فريدا من نوعه. يحتوي اختبار MEMA النموذجي على أكثر من 2500 بيئة صغيرة مؤتلفة فريدة من نوعها تتعرض لها الخلايا في اختبار واحد. كحالة اختبار، تم طلاء خط خلايا سرطان الثدي MCF7 على منصة MEMA. وقد حدد تحليل هذا التحليل العوامل التي تعزز وتعوق نمو وانتشار هذه الخلايا. منصة MEMA مرنة للغاية ويمكن تمديدها للاستخدام مع المسائل البيولوجية الأخرى خارج أبحاث السرطان.

Introduction

يبقى زراعة خطوط الخلايا السرطانية على البلاستيك في الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) واحدة من خيول العمل الرئيسية للباحثين عن السرطان. ومع ذلك، يتم الاعتراف بشكل متزايد البيئة الدقيقة لقدرتها على التأثير على الأنماط الظاهرية الخلوية. في السرطان، ومن المعروف أن البيئة الدقيقة الورم تؤثر على السلوكيات الخلوية متعددة، بما في ذلك النمو، والبقاء على قيد الحياة، والغزو، والاستجابة للعلاج1،2. عادة ما تفتقر ثقافات الخلايا أحادية الطبقة التقليدية إلى تأثيرات البيئة الدقيقة، مما أدى إلى تطوير تجارب ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) أكثر تعقيداً لزراعة الخلايا، بما في ذلك مستخلصات غشاء الطابق السفلي النقي المتاحة تجارياً. ومع ذلك، فإن هذه المصفوفات النقية عادة ما تكون معقدة للاستخدام وتعاني من مشاكل تقنية مثل تقلب الدفعة3 والتركيبات المعقدة3. ونتيجة لذلك، قد يكون من الصعب تعيين وظيفة لبروتينات محددة قد تؤثر على الأنماط الظاهرية الخلوية3.

لمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير تقنية microarray microenvironment (MEMA)، مما يقلل من البيئة الدقيقة وصولا ً إلى تركيبات بسيطة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبروتينات عامل النمو القابلة للذوبان4،5 . منصة MEMA تمكن من تحديد العوامل البيئية الصغرية المهيمنة التي تؤثر على سلوك الخلايا. باستخدام تنسيق صفيف، يمكن وضع حد لآلاف المجموعات من عوامل البيئة الدقيقة في تجربة واحدة. ال [مّا] يوصف هنا يستجوب ~2,500 مختلفة فريدة [ميكروفيول] شروط. البروتينات ECM المطبوعة في لوحات جيدا تشكل منصات النمو التي يمكن أن تكون المستزرعة الخلايا. يتم إضافة الأربطة القابلة للذوبان إلى الآبار الفردية، مما يخلق بيئات صغيرة مؤتلفة فريدة من نوعها (ECM + ligand) على كل بقعة مختلفة تتعرض لها الخلايا. يتم زراعة الخلايا لعدة أيام، ثم ثابتة، ملطخة، وصورة لتقييم الأنماط الظاهرية الخلوية نتيجة للتعرض لهذه تركيبات البيئة الدقيقة المحددة. وبما أن البيئات الدقيقة هي تركيبات بسيطة، فمن السهل تحديد البروتينات التي تدفع التغيرات الفينوتية الرئيسية في الخلايا. وقد استخدمت MEMAs بنجاح لتحديد العوامل التي تؤثر على الأنماط الظاهرية الخلويةالمتعددة، بما في ذلك تلك التي تدفع قرارات مصير الخلية والاستجابة للعلاج 4،7. ويمكن التحقق من صحة هذه الاستجابات في تجارب بسيطة 2D ومن ثم يمكن تقييمها في ظل ظروف أن يلخص بشكل أكمل تعقيد البيئة الدقيقة الورم. منصة MEMA قابلة للتكيف إلى حد كبير مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ونقاط النهاية، شريطة أن تتوفر علامات حيوية فينوتيبيك جيدة.

Protocol

ملاحظة: ويرد في الرسم التخطيطي للتدفق المبين في الشكل 1عرض عام للعملية MEMA بأكملها، بما في ذلك الوقت المقدر. هذا البروتوكول تفاصيل تصنيع MEMAs في لوحات 8-جيدا. قد يتم تكييف البروتوكول للوحات أو شرائح أخرى. 1. إعداد البروتين، ومخفف، وتلطيخ المخازن المؤقتة</…

Representative Results

ولتبسيط الآثار البيئية الدقيقة على نمو الخلايا وانتشارها وتحديد الظروف التي تعزز أو تمنع نمو الخلايا وانتشارها، تم زرع خط خلايا سرطان الثدي MCF7 على مجموعة من ثمانية من الاتفاقيات البيئية المتوسطة والمتوسطة 8 الآبار على النحو المبين في البروتوكول. وقد عرّض هذا التقييم الخلايا إلى 48 جهازاً …

Discussion

كانت أهمية “الأبعاد” والسياق عاملاً محفزاً في تطوير أنظمة الثقافة المختبرية كأدوات في توصيف الخلايا السرطانية من خلال تفاعلها مع البيئة الدقيقة11،وقدرة المختبر نظم الثقافة لتقليد البيئة في الجسم الحي هو القوة الدافعة وراء السعي لتحسين تلك النظم الثقافية. في النظم المختبرية،…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مكتبة الصندوق المشترك للشبكات (LINCS) منحة HG008100 (J.W.G., L.M.H., وJ.E.K).

Materials

Aushon 2470 Aushon BioSystems Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA Nikon High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler BioTek liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution Sigma T2069
EDTA Invitrogen 15575-038
Glycerol Sigma G5516
Triton X100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P7949
Kolliphor P338 BASF 50424591
384-well microarray plate, cylindrical well Thermo Fisher ab1055
Nunc 8 well dish Thermo Fisher 267062
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Science 15710
BSA Fisher BP-1600
Sodium Azide Sigma S2002
Cell Mask Molecular Probes H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor Molecular Probes C10357
DAPI Promo Kine PK-CA70740043
ALCAM R & D Systems 656-AL ECM
Cadherin-20 (CDH20) R & D Systems 5604-CA ECM
Cadherin-6 (CDH6) R & D Systems 2715-CA ECM
Cadherin-8 (CDH8) R & D Systems 188-C8 ECM
CD44 R & D Systems 3660-CD ECM
CEACAM6 R & D Systems 3934-CM ECM
Collagen I Cultrex 3442-050-01 ECM
Collagen Type II Millipore CC052 ECM
Collagen Type III Millipore CC054 ECM
Collagen Type IV Sigma C5533 ECM
Collagen Type V Millipore CC077 ECM
COL23A1 R & D Systems 4165-CL ECM
Desmoglein 2 R & D Systems 947-DM ECM
E-cadherin (CDH1) R & D Systems 648-EC ECM
ECM1 R & D Systems 3937-EC ECM
Fibronectin R & D Systems 1918-FN ECM
GAP43 Abcam ab114188 ECM
HyA-500K R & D Systems GLR002 ECM
HyA-50K R & D Systems GLR001 ECM
ICAM-1 R & D Systems 720-IC ECM
Laminin Sigma L6274 ECM
Laminin-5 Abcam ab42326 ECM
Lumican R & D Systems 2846-LU ECM
M-Cad (CDH15) R & D Systems 4096-MC ECM
Nidogen-1 R & D Systems 2570-ND ECM
Osteoadherin/OSAD R & D Systems 2884-AD ECM
Osteopontin (SPP) R & D Systems 1433-OP ECM
P-Cadherin (CDH3) R & D Systems 861-PC ECM
PECAM1 R & D Systems ADP6 ECM
Tenascin C R & D Systems 3358-TC ECM
VCAM1 R & D Systems ADP5 ECM
vitronectin R & D Systems 2308-VN ECM
Biglycan R & D Systems 2667-CM ECM
Decorin R & D Systems 143-DE ECM
Periostin R & D Systems 3548-F2 ECM
SPARC/osteonectin R & D Systems 941-SP ECM
Thrombospondin-1/2 R & D Systems 3074-TH ECM
Brevican R & D Systems 4009-BC ECM
Elastin BioMatrix 5052 ECM
Fibrillin Lynn Sakai Lab OHSU N/A ECM
ANGPT2 RnD_Systems_Own 623-AN-025 Ligand
IL1B RnD_Systems_Own 201-LB-005 Ligand
CXCL8 RnD_Systems_Own 208-IL-010 Ligand
IGF1 RnD_Systems_Own 291-G1-200 Ligand
TNFRSF11B RnD_Systems_Own 185-OS Ligand
BMP6 RnD_Systems_Own 507-BP-020 Ligand
FLT3LG RnD_Systems_Own 308-FK-005 Ligand
CXCL1 RnD_Systems_Own 275-GR-010 Ligand
DLL4 RnD_Systems_Own 1506-D4-050 Ligand
HGF RnD_Systems_Own 294-HGN-005 Ligand
Wnt5a RnD_Systems_Own 645-WN-010 Ligand
CTGF Life_Technologies_Own PHG0286 Ligand
LEP RnD_Systems_Own 398-LP-01M Ligand
FGF2 Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG Ligand
FGF6 RnD_Systems_Own 238-F6 Ligand
IL7 RnD_Systems_Own 207-IL-005 Ligand
TGFB1 RnD_Systems_Own 246-LP-025 Ligand
PDGFB RnD_Systems_Own 220-BB-010 Ligand
WNT10A Genemed_Own 90009 Ligand
PTN RnD_Systems_Own 252-PL-050 Ligand
BMP3 RnD_Systems_Own 113-BP-100 Ligand
BMP4 RnD_Systems_Own 314-BP-010 Ligand
TNFSF11 RnD_Systems_Own 390-TN-010 Ligand
CSF2 RnD_Systems_Own 215-GM-010 Ligand
BMP5 RnD_Systems_Own 615-BMC-020 Ligand
DLL1 RnD_Systems_Own 1818-DL-050 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 296-HR-050 Ligand
KNG1 RnD_Systems_Own 1569-PI-010 Ligand
GPNMB RnD_Systems_Own 2550-AC-050 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 350-NS-010 Ligand
IL15 RnD_Systems_Own 247-ILB-005 Ligand
TNF RnD_Systems_Own 210-TA-020 Ligand
IGFBP3 RnD_Systems_Own 675-B3-025 Ligand
WNT3A RnD_Systems_Own 5036-WNP-010 Ligand
PDGFAB RnD_Systems_Own 222-AB Ligand
AREG RnD_Systems_Own 262-AR-100 Ligand
JAG1 RnD_Systems_Own 1277-JG-050 Ligand
BMP7 RnD_Systems_Own 354-BP-010 Ligand
TGFB2 RnD_Systems_Own 302-B2-010 Ligand
VEGFA RnD_Systems_Own 293-VE-010 Ligand
IL6 RnD_Systems_Own 206-IL-010 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 351-FS-010 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 378-SM Ligand
IGFBP2 RnD_Systems_Own 674-B2-025 Ligand
SHH RnD_Systems_Own 1314-SH-025 Ligand
FASLG RnD_Systems_Own 126-FL-010 Ligand

References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

Play Video

Cite This Article
Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D., Gross, S., Sudar, D., Bucher, E., Nederlof, M., Dane, M., Gray, J. W., Heiser, L., Korkola, J. E. Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer. J. Vis. Exp. (147), e58957, doi:10.3791/58957 (2019).

View Video