Summary

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Published: November 26, 2018
doi:

Summary

Marjinal zon B hücreleri (MZBs) kesme akışı gücüne geçiş yollarına kadar debi yeniden yönlendirme tarafından yanıt. Bu iletişim kuralı, kayıt ve analiz akışkanlar birim, pompa, mikroskop görüntüleme sistemi ve özgür yazılım kullanarak geçiş gösterilmiştir.

Abstract

Marjinal zon B hücreleri (MZBs) köklerinin örtmek fare splenik marjinal bölgeler içinde bulunan B hücreler nüfusu vardır. Folikülleri ulaşmak için MZBs kan akışını kesme kuvvetleri kadar geçirmeniz gerekir. Biz burada bu akış kaynaklı MZB geçiş tüp bebek analiz etmek için bir yöntem mevcut. İlk olarak, MZBs fare dalak izole edilmiştir. İkinci olarak, MZBs integrin ligandlar akışı odası slaytlarında yerleşmiş, akış yamultmak için maruz ve mikroskop altında geçiş sırasında görüntüsü. Üçüncü olarak, geçirme MZBs görüntülerini eklenti için ImageJ izleme MTrack2 otomatik hücre kullanılarak işlenir ve Ibidi kemotaksisi aracını kullanarak elde edilen hücre parça sayılabilir. Göç veri hücreleri nasıl hızlı hareket, ne kadar sıklıkla yönünü değiştirmek, yamultma akışı vektör kendi geçiş yönünü etkileyip ve hangi integrin ligandlar söz konusu ortaya koyuyor. Biz MZBs kullansa da, yöntem kolayca kesme akışı gücüne yanıt verir herhangi bir lökosit göç analiz etmek için adapte edilebilir.

Introduction

Bağışıklık hücreleri insan vücudunda en hareketli hücreler ve sık sık kan ve lenf akıştan kesme kuvvetleri ile uğraşmak zorundadır. Ancak, kesme kuvvetleri kaynaklı göç lökosit1,2,3,4,5nispeten az çalışma vardır. Burada bir bağışıklık hücre yanıt akış tüp bebek için analiz etmek için güvenilir ve nicel bir iletişim kuralı mevcut. Tahlil gerçekleştirmek bileşenleri imalatı gerekmez ve tüm ekipmanları ve sarf malzemeleri ticari olarak kullanılabilir. Hücre analizi, arıtma ve geçiş dahil olmak üzere iletişim kuralı, bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Son olarak, her ne kadar biz göç marjinal zon B hücre (MZBs) tanımlamak, protokol geçiş akış bağışıklık hücreleri başka tür karşı analiz etmek için uyarlanabilir. Bu nedenle, bu tahlil sistematik olarak geniş bir lökosit koşulların kapsamlı bir paneliyle çözümle kullanmak mümkün olabilir.

MZBs olan nüfus, fare, sadece dalak ve servisi bulunan B hücre iç köklerinin ve marjinal bölgeler6,7,8,9arasında. Marjinal zon bağışıklık hücreleri yaklaşık 5-10 hücre kalın bir katmandır. Hücre katmanı folikül zarf ve öncelikle MZBs ve makrofajlar ama aynı zamanda değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri, dendritik hücreler (DC) ve nötrofil, diğerleri arasında10oluşur. Marjinal zon hücrelerinde folikül çevreleyen bir marjinal sinüs sonlandırmak splenik arter kaynaklanan tek yönlü kan akışına maruz kalır. Kan marjinal bölgesi ile marjinal sinüs delikleri üzerinden akar ve sonra kırmızı hamuru venöz sinüsler içinde toplanır ve dolaşım11‘ e geri. Serbest akışı kan MZBs üzerinde yıkar ve onları kanda taşınan antijenleri için ortaya çıkarır. MZBs antijen kan maruz kalmaz folikül içinde ve marjinal zon arasında mekik tarafından otomatik olarak folikül taşımak. Böylece, folikül doğru MZBs Servisi, kan akışı12 (Şekil 1A) kesme kuvvetleri kadar geçirmeniz gerekir.

Bu iletişim kuralı, kantitatif MZBs hiçbir akışı veya yüksek akış tüp bebek için yanıt gibi nasıl bağışıklık hücreleri belirlemek anlatan, içinde vivogeçirmek için nasıl olduklarını ortaya çıkarmak için programlanmış. İlk adımda, MZBs manyetik boncuklar karşı antikorlar için piyasada kitleri birleştiğinde kullanarak bir fare dalak gelen saf. Taze izole MZBs integrin ligandlar yerleşmek için izin, bir akış odası slayt kuyunun içine tanıtıldı ve pompa sistemi (Şekil 2A) kullanarak geçiş arabellek akışına maruz. Hücreleri bir time-lapse video mikroskobu sistemi kullanarak yansıma. Görüntüleri daha sonra otomatik olarak hücreleri izleme MTrack213,14, bir ücretsiz ImageJ eklentisi ile analiz için işlenir. Parça sonra hız, doğruluk ve geçiş dizin dahil olmak üzere çeşitli parametreleri belirlemek için ücretsiz Ibidi kemotaksisi aracı15 ile sayısal. Bu değerler bağışıklık hücre hareketi içinde vivo kontrol güçleri anlamak için kesme-akış indüklenen geçiş geçiş inhibitörleri, hücre uyarıcılar, kemokinler ve diğer geçiş etkileyen kimyasal etkileri belirlemek için kullanılabilir.

Protocol

Tüm deneylerin hayvanlar kullanımını içeren önceden Landesverwaltungsamt Halle tarafından (Saksonya-Anhalt), Almanya, Magdeburg övgü Üniversitesi Tıp Fakültesi tüm kılavuzlarınıza uygun olarak onaylanmış olması. 1. MZB hücre arıtma Lökosit yalıtmak. Bir 8-16 hafta-yaşlı fare kurban ve dalak16kaldırın. Dalak 5 ml buz gibi hücre arabellek ayırmak [fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) + %0.5 yağ asidi iç…

Representative Results

Biz MZBs geçiş akış (0 dyn/cm2) olmadan ICAM-1-kaplı slaytlarda karşılaştırmak için yukarıda belirtilen protokolü kullanılan ve akış (4 dyn/cm2) yamultmak için maruz. Hücreleri otomatik olarak MTrack2 ve dosyaları overlaid elde edilen parça ile hücre göç film akışı yoktur (0 dyn/cm2) ve (4 dyn/cm2) dağılımını göstermek için ve parça (Şekil 4A) şeklinde takip. Hücre parça parça a…

Discussion

Biz burada geçiş kesme akış gücü algılayan ve onların geçiş değiştirerek yanıt hücre analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. MZBs bir analizini MZBs kendiliğinden ICAM-1 ve akış huzurunda geçirmek, akış geçireceği gösterdi. Önceki çalışmalarda, MZBs kadar debi VCAM-1 geçiş ama bunun yerine yerde sabit kalır gösterdi. İçerirken, kırmızı hamuru ICAM-1 ve VCAM-1 fare splenik marjinal zon esas olarak ICAM-1, içerir. Bu veri, MZBs kadar debi marjinal zon ama kırmızı hamuru i?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser K.-D.F. için “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 gelen hibe tarafından desteklenmiştir

Materials

VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
  14. . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
  15. . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  17. . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
  18. . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)

Play Video

Cite This Article
Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

View Video