Summary

Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro

Published: November 26, 2018
doi:

Summary

Cellules (MZBs) de la zone marginale B répondent à la force du flux de cisaillement de réorienter leur voie de migration vers le haut de la circulation. Ce protocole indique comment enregistrer et analyser la migration à l’aide d’un appareil fluidique, pompe, microscope système d’imagerie et des logiciels libres.

Abstract

Cellules de B de la zone marginale (MZBs) sont une population de cellules de B qui résident dans les zones marginales spléniques de souris qui enveloppent les follicules. Pour atteindre les follicules, MZBs doit migrer vers le haut de la force de cisaillement de la circulation sanguine. Nous présentons ici une méthode pour analyser cette migration MZB induite par le flux in vitro. Tout d’abord, les MZBs sont isolées de la rate de souris. En second lieu, MZBs sont installés sur des ligands de l’intégrine dans les diapositives de chambre de flux, exposés au flux de cisaillement et imagés sous un microscope lors de la migration. En troisième lieu, des images des MZBs de migration sont traitées à l’aide de la cellule automatique de MTrack2 suivi de plugin pour ImageJ, et les pistes de cellules qui en résultent sont quantifiés à l’aide de l’outil de chimiotactisme Ibidi. Les données de migration révèlent comment rapidement déplacent les cellules, combien de fois ils changent de direction, si le vecteur flux de cisaillement affecte leur direction de migration et les ligands de l’intégrine sont impliqués. Même si nous utilisons MZBs, la méthode peut facilement être adaptée pour l’analyse de migration des leucocytes qui répond à la force du flux de cisaillement.

Introduction

Les cellules immunitaires sont les cellules les plus mobiles dans le corps humain et doivent souvent composer avec la force de cisaillement de la circulation sanguine et lymphatique. Cependant, il y a relativement peu d’études sur les migrations induite par la force de cisaillement de leucocytes1,2,3,4,5. Nous présentons ici un protocole fiable et quantitatif pour analyser la réponse d’une cellule immunitaire au flux in vitro. Réalisation de l’essai ne requiert pas de fabrication de composants, et tous les équipements et les consommables sont disponibles dans le commerce. Le protocole, y compris l’analyse de purification et de la migration cellulaire, peut être effectué en une seule journée. Enfin, bien que nous décrivons la migration des cellules de B de la zone marginale (MZBs), le protocole peut être adapté pour analyser des migrations contre flux d’autres types de cellules immunitaires. Il est donc possible d’utiliser ce test pour analyser systématiquement un large éventail des leucocytes avec un panel exhaustif des conditions.

MZBs sont une population de cellules de B qui, chez la souris, se trouvent uniquement dans la rate et la navette entre l’intérieur des follicules et les zones marginales6,7,8,9. La zone marginale est une couche de cellules immunitaires environ 5 à 10 cellules épais. La couche de cellules enveloppe du follicule et compose principalement de MZBs et macrophages mais également les cellules T (iNKT) tueuses naturels invariants, les cellules dendritiques (CD) et neutrophiles, entre autres,10. Les cellules de la zone marginale sont exposés au flux unidirectionnel de sang provenant des artères spléniques qui se terminent par un sinus marginal entourant le follicule. Le sang coule des trous dans le sinus marginal par le biais de la zone marginale et est puis recueilli dans les sinus veineux dans la pulpe rouge et restauré à la circulation de11. La libre circulation du sang se lave au cours des MZBs et les expose aux antigènes transportés dans le sang. Les MZBs portent l’antigène dans le follicule par navette automatiquement entre la zone marginale et à l’intérieur du follicule, ce qui n’est pas exposé à du sang. Ainsi, comme MZBs navette vers le follicule, ils doivent migrer vers le haut de la force de cisaillement de l’ écoulement de sang12 (Figure 1 a).

Dans ce protocole, nous décrivons comment déterminer quantitativement comment immunitaire cellules tels que MZBs répondre à aucun débit ou haut débit in vitro, afin de révéler comment ils sont programmés pour migrer in vivo. Dans un premier temps, MZBs sont purifiés de la rate de souris à l’aide de billes magnétiques couplées à l’anticorps de kits disponibles dans le commerce. Les MZBs fraîchement isolées sont introduits dans le puits d’une coulée de chambre, autorisés à s’installer sur des ligands de l’intégrine et exposées à l’écoulement du tampon de migration à l’aide d’un système de pompe (Figure 2 a). Les cellules sont imagés à l’aide d’un système de microscopie vidéo Time-lapse. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse avec un plugin d’ImageJ gratuit,13,MTrack214, pour suivre automatiquement les cellules. Titres peuvent ensuite être quantifiés avec Ibidi chimiotactisme gratuit outil15 à déterminer différents paramètres, notamment la vitesse, de rectitude et indice de migration. Ces valeurs peuvent être utilisées pour déterminer les effets des inhibiteurs de la migration, stimulateurs de la cellule, chimiokines et autres produits chimiques d’affecte la migration sur la migration de cisaillement-flux induit afin de comprendre les forces qui contrôlent le mouvement de cellules immunitaires in vivo.

Protocol

Toutes les expériences impliquant l’utilisation d’animaux ont été préalablement approuvés par le Landesverwaltungsamt de Halle (Saxe-Anhalt), Allemagne, conformément à toutes les directives de la faculté de médecine de l’Université OVGU de Magdebourg. 1. Purification de cellules MZB Isoler les leucocytes. Sacrifier un 8 à 16 semaines souris et enlever la rate16. Dissocier la rate dans 5 mL de tampon de cellule glac?…

Representative Results

Nous avons utilisé le protocole décrit ci-dessus pour comparer la migration des MZBs sur des lames ICAM-1-enduit sans écoulement (0 dyn/cm2) et exposés pour déformer les flux (4 dynes/cm2). Les cellules ont été suivies automatiquement avec MTrack2 et la piste qui en résulte des fichiers ont été superposées sur les films de migration cellulaire sans écoulement (0 dyn/cm2) et (4 dynes/cm2) pour montrer la répartition et la forme de la…

Discussion

Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de la migration des cellules qui détectent la force du flux de cisaillement et répondre en altérant leur migration. Une analyse de MZBs a montré que les MZBs migrer spontanément sur ICAM-1 et en présence de débit, va migrer vers le haut de la circulation. Dans nos travaux précédents, nous avons montré que MZBs ne migrent pas vers le haut le flux sur VCAM-1, mais au contraire restent fixes en place. La zone marginale splénique murine contient principalement ICAM…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la « Deutsche Forschungsgemeinschaft » SFB 854/TP11 à K.-D.F.

Materials

VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
  14. . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
  15. . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  17. . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
  18. . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)

Play Video

Cite This Article
Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

View Video