Summary

Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Published: November 26, 2018
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Summary

Células B de zona marginal (MZBs) respondem à força de cisalhamento do fluxo por reorientar seu caminho de migração o fluxo. Este protocolo mostra como gravar e analisar a migração usando uma unidade de fluidics, bomba, sistema de imagem de microscópio e software livre.

Abstract

Células B de zona marginal (MZBs) são uma população de células B que residem nas zonas marginal esplênica rato que envolvem os folículos. Para alcançar os folículos, MZBs deve migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue. Apresentamos aqui um método para analisar essa migração de MZB fluxo induzido in vitro. Primeiro, MZBs são isolados do baço de rato. Em segundo lugar, MZBs são liquidadas no integrina ligands em slides de câmara de fluxo, expostos ao fluxo de cisalhamento e fotografadas sob um microscópio durante a migração. Em terceiro lugar, imagens de MZBs a migração são processadas usando a célula automática MTrack2 plugin de rastreamento para ImageJ, e as faixas de célula resultante são quantificadas utilizando a ferramenta de quimiotaxia Ibidi. Os dados de migração revelam quão rápido as células mover, quantas vezes eles mudam de direção, se o vetor de fluxo de distorção afeta sua direção de migração e quais integrina ligantes estão envolvidos. Embora nós usamos MZBs, o método pode ser facilmente adaptado para a análise de migração de qualquer leucócito que responde à força de cisalhamento do fluxo.

Introduction

Células do sistema imune são as células mais motile no organismo humano e muitas vezes têm que lidar com a força de cisalhamento do fluxo de sangue e da linfa. No entanto, existem relativamente poucos estudos sobre a migração induzida por força de cisalhamento de leucócitos1,2,3,4,5. Apresentamos aqui um protocolo confiável e quantitativo para analisar a resposta de uma célula imune ao fluxo in vitro. Realizar o ensaio não exige a fabricação de componentes, e todos os equipamentos e bens de consumo estão disponíveis comercialmente. O protocolo, incluindo análise de purificação e migração de células, pode ser executado em um único dia. Finalmente, embora descrevemos a migração de células B de zona marginal (MZBs), o protocolo pode ser adaptado para analisar a migração contra fluxo de outros tipos de células do sistema imunológico. Portanto, é possível usar este teste para analisar sistematicamente uma ampla gama de leucócitos com um painel abrangente das condições.

MZBs são uma população de células B que, no rato, são encontrados apenas no baço e no serviço de transporte entre o interior dos folículos e as zonas marginais6,7,8,9. A zona marginal é uma camada de células imunitárias aproximadamente 5 a 10 células grossas. A camada de células envolve o folículo e consiste principalmente de MZBs e macrófagos, mas também invariável naturais assassinos (iNKT) as células T, células dendríticas (DCs) e os neutrófilos, entre outros10. As células da zona marginal são expostas ao fluxo unidirecional de sangue provenientes de artérias esplênica que terminam em um seio marginal ao redor do folículo. O sangue flui de buracos no seio marginal através da zona marginal é coletado em seios venosos na polpa vermelha e restaurado para a circulação de11. O fluxo livre do sangue lava sobre os MZBs e expõe-los aos antígenos transportados no sangue. Os MZBs carregam o antígeno para o folículo por vaivém automaticamente entre a zona marginal e dentro do folículo, o que não é exposto ao sangue. Assim, como MZBs shuttle para o folículo, eles devem migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue12 (figura 1A).

Neste protocolo, descrevemos como determinar quantitativamente como imune as células tais como MZBs responder sem fluxo ou fluxo elevado in vitro, a fim de revelar como eles são programados para migrar em vivo. Na primeira etapa, MZBs são purificados de um baço de rato usando grânulos magnéticos acoplados aos anticorpos de kits disponíveis comercialmente. Os MZBs recentemente isoladas são introduzidos dentro do poço de um slide de câmara de fluxo, permitiu resolver para ligantes integrina e expostos ao fluxo de buffer de migração usando um sistema de bomba (Figura 2A). As células são fotografadas usando um sistema de Time-Lapse vídeo microscopia. As imagens são então processadas para análise com um plugin grátis ImageJ,13,MTrack214, para controlar automaticamente as células. Faixas em seguida podem ser quantificadas com o livre Ibidi quimiotaxia ferramenta15 para determinar vários parâmetros, incluindo velocidade, retidão e índice de migração. Estes valores podem ser usados para determinar os efeitos de inibidores de migração, estimuladores de célula, quimiocinas e outros produtos químicos que afetam a migração para a migração de cisalhamento-fluxo induzido a fim de compreender as forças que controla o movimento de células imunes in vivo.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo o uso de animais foram previamente aprovados pelo Landesverwaltungsamt Halle (Saxónia-Anhalt), Alemanha, em conformidade com todas as orientações da faculdade de medicina da Universidade OVGU de Magdeburg. 1. MZB célula purificação Isole os leucócitos. Sacrificar um 8 a 16 semanas de mouse e remover o baço16. Dissociar o baço em 5 mL de tampão de cela gelada [tampão fosfato salino (PBS) + …

Representative Results

Usamos o protocolo descrito acima, para comparar a migração de MZBs em slides de ICAM-1-revestido sem fluxo (0 dyn/cm2) e exposto para distorcer o fluxo (4 dyn/cm2). As células foram rastreadas automaticamente com MTrack2 e a faixa resultante arquivos foram sobrepostos sobre os filmes de migração celular de nenhum fluxo (0 dyn/cm2) e (4 dyn/cm2) para mostrar a distribuição e a forma das faixas (Figura 4A). Fa…

Discussion

Descrevemos aqui um método para analisar a migração de células que a força de cisalhamento do fluxo de detectar e responder, alterando sua migração. Uma análise de MZBs mostrou que MZBs migrar espontaneamente no ICAM-1 e na presença de fluxo, migrará o fluxo. No nosso trabalho anterior, mostramos que MZBs não migrar o fluxo na VCAM-1, mas em vez disso, permanecem fixos no lugar. A zona marginal esplênica murino contém principalmente a ICAM-1, enquanto a polpa vermelha contém ICAM-1 e VCAM-1. A partir desses…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por concessões do “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 para K.-D.F.

Materials

VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

References

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Cite This Article
Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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