Summary

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Published: November 26, 2018
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Summary

Randzone B Zellen (MZBs) reagieren auf die Kraft des Schubflusses Neuausrichtung ihrer Migrationspfad bis die Strömung. Dieses Protokoll zeigt, wie Sie erfassen und analysieren der Migration mit einem Fluidik-Einheit, Pumpe, Mikroskop-imaging-System und freie Software.

Abstract

Randzone B Zellen (MZBs) sind eine Population von B-Zellen, die in der Maus Milz Randzonen befinden, die Follikel zu umhüllen. Um die Follikel zu erreichen, muss die Schubkraft des Blutflusses MZBs wandern. Wir stellen Ihnen hier eine Methode für die Analyse dieser strömungsinduzierte MZB-Migration in-vitro. Erstens sind MZBs isoliert aus der Maus Milz. Zweitens sind MZBs ließ sich auf Integrin Liganden in Fluss Kammer Folien, Fluss Scherung ausgesetzt und abgebildet unter dem Mikroskop während der Migration. Drittens Bilder von der Migration von MZBs werden mit der MTrack2 automatische Zelle tracking-Plugin für ImageJ verarbeitet, und die daraus resultierenden Zelle Tracks mit dem Ibidi Chemotaxis Werkzeug quantifiziert. Die Migrationsdaten zeigen, wie schnell sich die Zellen bewegen, wie oft sie die Richtung ändern, ob der Scherung Fluss Vektor ihre Migration Richtung auswirkt und welche Integrin-Liganden beteiligt sind. Obwohl wir MZBs verwenden, kann die Methode leicht angepasst werden für die Analyse der Migration Leukozyten, die auf die Kraft des Schubflusses reagiert.

Introduction

Immunzellen sind die meisten bewegliche Zellen im menschlichen Körper und müssen oft mit Querkraft von Blut und Lymphe Strömung kämpfen. Allerdings gibt es vergleichsweise wenige Studien auf Scherung Kraft-induzierte Migration von Leukozyten1,2,3,4,5. Wir stellen Ihnen hier eine zuverlässige und quantitative Protokoll um die Reaktion der einer Immunzelle auf in-vitro-Fluss zu analysieren. Durchführung des Tests erfordert keine Herstellung von Komponenten und alle Geräte und Verbrauchsmaterialien sind im Handel erhältlich. Das Protokoll, einschließlich Reinigung und Migration Zellanalyse, kann an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Schließlich, obwohl wir die Migration der Randzone B-Zellen (MZBs) beschrieben wird, kann das Protokoll angepasst werden um Migration gegen andere Arten von Immunzellen zu analysieren. Daher ist es möglich, dieser Assay verwenden, um eine Vielzahl von Leukozyten mit einer umfangreichen Gruppe von Bedingungen systematisch zu analysieren.

MZBs sind eine Population von B-Zellen, die in der Maus, nur in der Milz und Shuttle gefunden werden, zwischen dem Innenraum der Follikel und die Randzonen6,7,8,9. Die Randzone ist eine Schicht von Immunzellen ca. 5 – 10 Zellen dick. Die Zellschicht die Follikel umhüllt und besteht hauptsächlich aus MZBs und Makrophagen, aber auch invariante natürlichen killer (iNKT) T-Zellen, dendritischen Zellen (DCs) und Neutrophilen, unter anderem10. Die Zellen in der Randzone sind unidirektional Blutfluss aus Milz Arterien, die marginale Sinus rund um die Follikel kündigen ausgesetzt. Das Blut wird fließt aus den Löchern in den marginalen Sinus durch die Randzone und dann in venösen Sinus in dem roten Fruchtfleisch gesammelt und restauriert im Umlauf-11. Der freie Fluss von Blut wäscht über den MZBs und setzt sie auf Antigene im Blut durchgeführt. Die MZBs tragen das Antigen in der Follikel transportiert automatisch zwischen der Randzone und innerhalb der Follikel, die nicht Blut ausgesetzt ist. So müssen sie als MZBs Shuttle in Richtung der Follikel, die Schubkraft der Blut fließen12 (Abbildung 1A) Wandern.

In diesem Protokoll wir beschreiben, wie quantitativ zu bestimmen, wie die Immunzellen wie keine Strömung oder high-Flow-in-vitro-MZBs reagieren, um aufzuzeigen, wie sie sind so programmiert, dass um in Vivozu migrieren. In einem ersten Schritt werden aus einer Maus Milz mit magnetischen Beads gekoppelt an Antikörper aus handelsüblichen Kits MZBs gereinigt. Frisch isolierte MZBs sind in den Brunnen einer Strömung Kammer Folie eingeführt, erlaubt, sich auf Integrin Liganden und den Fluss der Migration Puffer mit einem Pumpensystem (Abbildung 2A) ausgesetzt. Die Zellen werden mit einem Time-Lapse video-Mikroskopie-System abgebildet. Anschließend werden die Bilder zur Analyse mit einem kostenlosen ImageJ-Plugin, MTrack213,14, um die Zellen automatisch zu verfolgen. Spuren können dann mit dem kostenlosen Ibidi Chemotaxis Werkzeug15 verschiedene Parameter wie Geschwindigkeit, Geradheit und Migration Index bestimmen quantifiziert werden. Diese Werte können zu bestimmen, die Auswirkungen der Migration-Inhibitoren, Zelle Stimulatoren, Chemokine und andere Chemikalien Migration beeinflussen auf der Schubfluss induzierte Migration verwendet werden, um die Immunzelle Bewegungskontrolle in-vivo Kräfte zu verstehen.

Protocol

Alle Experimente, die die Verwendung von Tieren wurden zuvor durch das Landesverwaltungsamt Halle (Sachsen-Anhalt), Deutschland, nach allen Richtlinien der medizinischen Fakultät der OVGU Universität Magdeburg genehmigt. (1) MZB Zelle Reinigung Leukozyten zu isolieren. Opfern Sie ein 8 bis 16 Wochen altes Baby Maus zu und entfernen Sie der Milz-16. Die Milz in 5 mL eiskaltes Zelle Puffer zu trennen [Phosphat-gepufferte Kochsalzlö…

Representative Results

Wir verwendet das Protokoll beschriebenen Migration von MZBs auf ICAM-1-beschichtete Folien ohne Strömung (0 dyn/cm2) vergleichen und Fluss (4 dyn/cm2) Scherung ausgesetzt. Zellen wurden automatisch mit MTrack2 und die daraus resultierende Spur, die Dateien überlagert wurden verfolgt, auf die Zelle Migration Filme Stromstille (0 dyn/cm2) und (4 dyn/cm2) zeigen die Verteilung und Form der Tracks (Abb. 4A). Zelle wu…

Discussion

Wir beschreiben hier eine Methode für die Analyse der Migration von Zellen, die die Kraft des Schubflusses zu erkennen und durch Veränderung ihrer Migration zu reagieren. Eine Analyse der MZBs zeigte, dass MZBs migrieren spontan auf ICAM-1 und im Beisein von fließen, werden migriert, bis die Strömung. In unserer bisherigen Arbeit haben wir gezeigt, dass MZBs nicht den Fluss von VCAM-1 migrieren aber stattdessen fixiert. Der murinen Milz Randzone enthält hauptsächlich ICAM-1, während das rote Fruchtfleisch ICAM-1 u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem “Deutschen Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11, K.-D.F

Materials

VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
  14. . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
  15. . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  17. . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
  18. . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)

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Cite This Article
Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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