Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.
Abstract
Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras antimicrobianas similares a la web que consisten en proteínas antimicrobianas derivadas del ADN y del gránulo. La microscopía de inmunofluorescencia y los métodos de cuantificación basados en imágenes siguen siendo herramientas importantes para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos. Sin embargo, existen limitaciones clave en los métodos basados en la inmunofluorescencia que actualmente están disponibles para cuantificar los NET. Los métodos manuales de cuantificación de NET basada en imágenes suelen ser subjetivos, propensos a errores y tediosos para los usuarios, especialmente los usuarios no experimentados. Además, las opciones de software disponibles actualmente para la cuantificación son semiautomáticas o requieren capacitación antes de la operación. Aquí, demostramos la implementación de un método automatizado de cuantificación de imágenes basado en inmunofluorescencia para evaluar la formación NET denominada NETQUANT. El software es fácil de usar y tiene una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar. Considera parámetros biológicamente relevantes como un aumento en la superficie y la relación de proteína de marcador DNA:NET, y la deformación nuclear para definir la formación de NET. Además, esta herramienta se construye como una aplicación de libre disposición, y permite la cuantificación y el análisis de la resolución de una sola celda.
Introduction
Los neutrófilos son mediadores cruciales de las respuestas de defensa innatas del huésped contra una amplia variedad de patógenos microbianos1. Ejecutan sus funciones antimicrobianas liberando sus gránulos que contienen una amplia gama de proteínas antimicrobianas2,produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) e hipoclorito1,y a través de fagocitosis3. Además, Brinkmann et al. 4 describió las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) como un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos atrapan y eliminan los patógenos invasores. Desde su descubrimiento hace poco más de una década4, los NETs se han implicado en una amplia variedad de infecciosos5,6 y no infeccioso7 morbilidades. La formación de REDES es un proceso activo y da como resultado la extrusión de ADN de cromatina recubierto con proteínas antimicrobianas derivadas de gránulos8. Algunos de los cambios clave en la morfología celular y nuclear asociados con la formación de REDES incluyen la pérdida de morfología nuclear, la descondensación de cromatina, la movilización de proteínas de gránulos desde el citoplasma al núcleo y un aumento en el diámetro nuclear y celular8,9.
Los NET similares a la web, que pueden aparecer como estructuras difusas ligeramente más grandes que la célula o como estructuras varias veces más grandes que un solo neutrófilo se consideran indicadores de NETosis5,10. Mediante la microscopía de fluorescencia, las NET se pueden detectar sondeando el ADN con una sonda fluorescente como 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y por la tinción de inmunofluorescencia contra proteínas ligadas a redes netasas como la aslastasa de neutrófilos. La cuantificación de áreas superpuestas de tinción para ADN y proteínas ligadas a REDES determina el área total bajo NETs en una imagen11.
Hay varias opciones de análisis de imágenes disponibles para realizar la cuantificación basada en imágenes por fluorescencia de los NET11,12. Pero estas opciones de software presentan limitaciones para no ser fáciles de usar y/ o totalmente automatizados. En este artículo, demostramos el funcionamiento de NETQUANT13, una aplicación de libre disponibilidad que puede realizar una cuantificación NET basada en imágenes basada en imágenes de microscopía de inmunofluorescencia totalmente automatizada imparcial. La aplicación tiene una interfaz gráfica fácil de usar (GUI) y puede realizar análisis de una sola célula. El software cuantifica la NETosis en una imagen mediante la detección de los cambios morfológicos en el área del marcador enlazado a LA RED de ADN, la deformación asociada a la descondensación de cromatina del núcleo y el aumento de la relación de proteínas enlazadas dnalo:NET. En conjunto, los múltiples criterios de definición de NET permiten una cuantificación estricta de NET en varios conjuntos de datos de forma imparcial.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formación NET es una adición relativamente reciente al diverso armamentario de neutrófilos4 y ha habido una notable oleada de interés para estudiar la implicación de los NETs en una amplia gama de áreas de investigación5,7,14,15. La adquisición de imágenes mediante microscopía de inmunofluorescencia y la cuantificación posterior basada en imágenes es un m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue financiado por la Fundación Crafoord (TM y PN), la beca sueca de investigación gubernamental (PN, TM), el Consejo de Investigación Sueco (PN) y la Fundación Groschinsky (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
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